不同吸收细胞的选择对Rh血型系统抗-G抗体综合鉴定的影响*

苏承丹，练栩辉，何 屹

1.成都市第八人民医院检验科，四川成都 610036；2.大竹县人民医院输血科，四川达州635100；3.四川省人民医院输血科，四川成都 610072

Rh血型系统是红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统[1]。Rh血型系统抗原属同种异型，其抗原性强，截至2019年7月，国际输血协会(ISBT)确认的Rh系统抗原达到55个，其中有5种主要抗原在临床上有重要意义，即D、E、e、C、c抗原[2]。此外，G抗原也是Rh血型系统的一种多态性抗原，且C和(或)D抗原阳性的红细胞几乎同时含有G抗原，临床上也已发现抗-G引起的输血反应及新生儿溶血病。但由于抗-G一般表现为既抗-C又抗-D，很难与抗-C和抗-D分开，在Rh阴性患者产生的抗体中，常只重视抗-D，仅选择RhD阴性的血液输注，而抗-C常常被忽视，导致输血反应的发生[3-4]。抗-G可以应用rG/dce或r/G/dce细胞经吸收/放散试验分离出来，但这类红细胞非常少见和难以得到[5]。抗-G在国内的报道不多，主要是由于G抗原的分子机制仍然不明，且Rh阴性个体在汉族人群中相对稀少[6]。在参考文献[7]的基础上，本研究选择O型Rh表型为CCdee和ccDee的红细胞来吸收该患者血清。抗-G抗体的鉴定理论上可以应用rG/dce 或r/G/dce 的红细胞，通过吸收/放散方式鉴定，但因这类细胞非常少见，一般采用双步放散试验来分离[8-9]。

1 资料与方法

1.1一般资料 患者，女，65岁，因贫血入院。入院后诊断为重度贫血、骨髓异常综合征。有输血史，孕3产1,血型复查A型，RhD阴性，不规则抗体筛查阳性。

1.2仪器与试剂 主要试剂：抗-A、抗-B、抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e试剂均由上海血液生物医药有限公司提供，另外两种抗-D试剂由北京金豪制药股份有限公司和Dominion biologicals公司提供，ABO 试剂红细胞由上海血液生物医药有限公司提供，抗体筛选细胞由江苏力博公司提供，抗体鉴定谱细胞由Sanquin公司提供，酸放散试剂由江苏力博公司提供。所有试剂均在有效期内使用。主要仪器：KA-2200久保田离心机，Grant JBN5水浴箱，Ortho Biovue system离心机、孵育器。

1.3方法 (1)ABO及Rh血型鉴定：使用Ortho Biovue卡式及盐水试管法，使用3种不同来源的抗-D试剂进行患者和献血者Rh阴性确认。(2)抗体筛查：使用Ortho Biovue卡式及盐水试管法按照试剂说明书操作规范进行。在卡式反应腔中加入血清40 μL,3%～4%试剂红细胞10 μL，低离子液50 μL，37 ℃孵育10 min后，在专用离心机离心5 min后观察结果。(3)抗体鉴定：使用Ortho Biovue卡式试管法按照试剂说明书操作规范进行。(4)吸收试验：吸收试验分为A、B两组，选用不同抗原表型红细胞，与患者血清1∶1混匀，置于37 ℃吸收30 min，每10 min轻摇试管，吸收后1 000×g离心1 min后分离上清液和压积红细胞。将第1次吸收试验的放散液作为第2次吸收试验的待吸收液。抗原表型为CCdee吸收细胞来源于经血液中心Rh阴性确认的献血者红细胞，抗原表型为ccDee吸收细胞来源于血液中心献血者红细胞。A组第1次吸收试验和第2次吸收试验分别选用抗原表型为ccDee和CCdee的红细胞，B组第1次和第2次吸收试验分别选用抗原表型为CCdee和ccDee的红细胞，对吸收后的放散液进行抗体鉴定。(5)放散试验：采用酸放散，将吸收后红细胞用生理盐水洗涤3次,每次洗涤后，1 000×g离心1 min，最后1次的洗涤液留作阴性对照。按试剂说明书，将试剂溶液Ⅰ与试剂溶液Ⅱ按照1∶4体积比混合制备成洗脱液2 mL。在2 mL洗脱液中加入1 mL待放散的压积红细胞，混匀。室温孵育1 min，加入0.1 mL试剂溶液Ⅲ，混匀，1 000×g离心1 min，分离得压积红细胞及上清液。将上清液移至另一干净的试管中，滴加试剂溶液Ⅲ，以溶液颜色由紫色转变为蓝色为反应终点。1 000×g离心3 min，上清液即为可用于抗体检测的放散液。

2 结 果

2.1血型及不规则抗体筛查结果 患者血型卡式法和盐水试管法筛查结果均为A型、RhD阴性，卡式不规则抗体筛查和盐水试管法Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均为3+。

2.2抗体特异性鉴定结果 从16组谱细胞的反应情况可以推断出可能为抗-C、抗-D抗体，对患者Rh血型系统进行分型，结果为ccdee。

2.3A、B两组试验对抗-C、抗-D和抗-G抗体的吸收放散结果 A组试验第1次吸收试验选用献血者O型抗原表型为ccDee红细胞,吸收后的上层清液和吸收后细胞放散液与4、5、9号谱细胞进行间接抗人球蛋白试验(IAT)，见表1。上清液仍可与抗原表位含ccDee和CCdee谱细胞反应，说明上清液中仍残存抗体，且类型无法确定，放散液与ccDee谱细胞反应，说明放散液中存在抗-D抗体，而放散液未与CCdee谱细胞反应，不符合抗-G抗体的特性，由此推断未检测出抗-G抗体，因此未进行第2次吸收放散试验。B组试验中，第1次吸收试验和第2次吸收试验分别选用抗原表型为CCdee和ccDee红细胞,见表2。

表1 A组试验结果

表2 B组试验结果

3 讨 论

G抗原为Rh 血型系统抗原， ISBT 中序号为Rh12，高加索人中表达频率为84%，黑种人为92%，亚洲人群中几乎为100%。RhD 和RhCE 的C 等位基因外显子2 编码的Ser103是G 抗原活性的关键，通常D 及C 阳性的红细胞上都存在G 抗原，但也有极少D 或C 阳性的红细胞没有G 抗原的案例报道。G抗原由ALLEN 和TIPPETT[10]于1958 年在美国的献血者中发现，该献血者表型为ccdee却可与抗-C、抗-D 反应，因红细胞膜上没有C 和D 抗原，但有G 抗原，能与抗-C、抗-D血清反应。从16组谱细胞反应情况推断出患者血型含有5种可能：抗-D合并抗-C，抗-G，抗-D合并抗-G，抗-C合并抗-G，抗-D、抗-C和抗-G 3种抗体混合存在。由于抗-G 可与D 和(或) C抗原阳性的红细胞反应，在临床实践中，易误认为抗-D或抗-C[11]。若要准确知道抗体类型，需进行吸收放散试验区分。

根据红细胞不同的抗原表型，选用只存在C或D抗原的细胞进行吸收后放散，均可进行区分抗-C、抗-D和抗-G。但是实际上由于Rh表型上G抗原位点数与Rh分型存在关联性，选用不同的细胞，吸收放散的结果截然不同。试验结果可见，使用ccDee的细胞吸收放散后，不与CCdee的细胞凝集，只与ccDee细胞凝集，说明放出抗体只有抗-D特性，无抗-C特性，不能推断出抗-G的存在。吸收后血清与ccDee、CCdee细胞凝集，只说明抗体有抗-D，抗-C特性。B组试验可见先用CCdee的细胞吸收放散后，放散液与ccDee、CCdee的细胞发生凝集，在没有抗-e的前提下，说明C抗原吸收的抗体同时带有抗-D的特性，存在抗-G和(或)抗-C。再用ccDee对放散液吸收后放散，检测出对ccDee和CCdee有凝集的抗体，进一步说明第1次吸收试验用CCdee吸收的抗体同时带有抗-C和抗-D的特性，血清中抗-C和抗-D是一个不能分离的整体，符合抗-G的特点。用ccDee的细胞吸收后血清不与CCdee反应，说明不含抗-C。本研究局限性在于未进行Rh阴性表型C抗原阳性的献血者细胞基因分型，Rh阴性表型C抗原阳性的红细胞大多有变异型弱D抗原表位，建议对Rh阴性表型C抗原阳性的谱细胞/献血者细胞进行基因分型，排除弱D抗原存在的可能性。

从A、B组试验看出，抗-G与C抗原反应强度大于D抗原[12]。SKOV[13]曾做过Rh表型上G抗原位点数,结果显示，G抗原位点在DCe/DCe表型上为9 900～12 200个，dCe/dCe有8 200～9 700个，DCE /DCE有5 400个，DcE/DcE 有3 600～5 800个，Dce/Dce有4 500～5 300个，DcE/dce有4 200个。dCe/dCe 的G抗原量远远多于DcE/DcE。这也是A组使用ccDee细胞未能有效吸收抗-G的原因。多次吸收和放散试验是在缺少稀有、特异性红细胞时，鉴定抗-G的简便实用方法[14]。但需要注意根据不同Rh表型红细胞上的G抗原的位点数不同来选择合适的吸收细胞进行吸收放散试验来推断抗-G，如dCe/dCe型。Rh阴性血型系统的不规则抗体约占48.84%，证实了临床检出的不规则抗体主要集中在Rh血型系统[15]。

此外，抗-G多与抗-D或抗-D、抗-C混合在一起，抗-G会封闭C和D位点，有时还会封闭e位点。这也是引起迟发性输血反应和新生儿溶血病并导致交叉配血不合的原因[16-18]。Rh阴性患者出现抗筛阳性时，可能同时存在抗-D、抗-C、抗-G，需进行抗体鉴定。有研究表明，ccdee(57.18%)表型明显多于Ccdee表型(30.25%)和CCdee表型(6.41%)[19]。RhD阴性血液的Rh分型可能为Ccdee，患者如果存在抗-G或抗-C，则不能输注。因此，在临床单独常规检测Rh血型系统RhD抗原是不能满足临床合理安全输血要求的，需对Rh血型系统主要的5种抗原常规进行检测，并给予Rh血型同型血液输注，可有效避免因输血而产生Rh同种抗体，减少输血风险，这也是未来精准输血的要求[20]。

抗-G抗体是一种兼有抗-D和抗-C两种特异性的不规则抗体，不仅可以引起溶血性输血反应，也会导致新生儿溶血病[21]。因此，对抗筛阳性的Rh阴性患者，应关注抗-G的问题，不同Rh表型红细胞上G抗原的位点不同，在进行鉴定时，应优先选择抗原位点更多的Rh表型为dCe/dCe的红细胞作为吸收细胞，以保证试验效果，确保输血安全。