半枝莲提取黄酮类化合物药理学研究进展

刘新杨，商亚珍

(承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室/河北省中医药抗痴呆重点研究室，河北承德 067000)

半枝莲为唇形科植物半枝莲(Scutellaria barbata D.Don)地上部分的干燥全草，别称赶山鞭、瘦黄芩、狭叶韩信草等，在我国拥有丰富的药用植物资源。它首见于蒋仪的《药镜拾遗赋》：“半枝莲,解蛇伤之仙草”。在明代的《外科正宗》中有半枝莲的相关记载,是中医处方和中成药中的常用中药[1]。半枝莲黄酮（scutellaria barbata flavonoids，SBF）是从半枝莲提取分离出的黄酮类有效成分，将其提取后进行药理学研究意义深远。半枝莲有抗肿瘤、抗氧化、抑菌等生物活性，临床上可以用来治疗肺腺癌、卵巢癌等。近年来研究发现，半枝莲有防治阿尔茨海默症(Alzheimer's disease，AD)作用，可能与其含有黄酮类化合物有关。本文将有关半枝莲黄酮类化合物近几年的研究进展加以总结，目的是为了挖掘出半枝莲的药用价值，促进半枝莲的临床应用。

1 半枝莲黄酮的制备

半枝莲提取的黄酮化合物具有多种医疗功效，对其开发利用前景十分广阔。许多科研开展了黄酮类化合物的提取方法研究，有传统和现代工艺手段。有关半枝莲中黄酮类化合物的提取方法众多，研究提取方法为半枝莲的综合开发提供一定的技术参考。

1.1 溶剂提取法

此法依据相似相溶原理,利用与黄酮类极性相似的提取溶剂，获取更多的黄酮类成分。张蜀艳等[2]探讨半枝莲中黄酮类物质提取的优化工艺，在单因素试验基础上开展响应面试验，实验获得数据表明，通过优化提取工艺,最终总黄酮提取率数据为7.26%，优化提取工艺中三个重要的条件为：溶剂乙醇浓度数据是74%，固液比数据是70:1(mL/g)，浸提时间数据是5h。何根祥等[3]开展此项研究，提取方法选择应用中心复合设计法，在单因子试验的基础上，乙醇浓度及其用量、提取时间作为优化工艺的三个重要的因子，提取工艺为：用药材16.46倍量64.24%乙醇溶液回流提取2次，每次1h，最终半枝莲总黄酮提取率为2.86%。何根祥等对此类实验的提取工艺优化角度不同,对比二种提取方案，提取工艺的影响因子选择不同，其结果也不同。半枝莲总黄酮的提取第一个实验比第二个实验多5.40%(7.26%~2.86%)。此溶剂提取法尚有提取液杂质多、提取成本高和操作复杂等缺点。

1.2 微波辅助提取法

微波辅助提取法优势在于绿色技术、强选择性、提取高效、周期缩短、操作简单、副产物减少，其具有频率高,微波能产生的热量能直接作用于细胞等优点。微波选择性加热促进植物细胞壁打开，有助于黄酮类成分溶出。文献报道，单绍军等[4]研究了微波辅助法从半枝莲中提取黄酮成分的工艺，实验因子变量选择了微波功率、溶剂因子等，研究得出结论，其最佳工艺条件为：选用半枝莲粉末2g，溶剂60mL85%乙醇，最佳微波功率500W，提取反应10min，最终黄酮提取率为2.9%。此实验确定了最佳微波功率与提取率关系。微波功率是200~600W之间，获得黄酮提取率依次对应2.0%~2.9%，分析数据，当功率为500W 以上时，提取率基本不变，故确认500W作为微波最佳提取功率。

1.3 超临界萃取法

超临界流体萃取技术是一种高新技术，优点是能保留天然药物所有有效成分，同时高效、安全、环保。超临界萃取技术的应用将极大提高SBF化合物活性成分提取率，技术原理是采用超临界流体作为溶剂使用，萃取可溶的溶质SBF。王霞等[5]研究采用此方法，优化了超临界温度、乙醇浓度以及萃取时间，最终SBF萃取率接近95%，黄酮得率高，鉴于结果理想，所以，超临界流体萃取技术值得在半枝莲提取中推广使用。

1.4 醇提酸沉法

承德医学院药理研究所提取黄酮类化合物采用醇提酸沉法，醇提酸沉法适用于提取黄酮类、香豆素类、带游离羟基的醌类化合物。在半枝莲中提取黄酮类化合物工艺流程如下：首先称取半枝莲药材，用一定倍量(约15倍量)的80%乙醇浸泡处理，浸泡时间约12h；接下来加热回流提取2次，温度控制在70℃以下，每次1h；收集合并提取液，减压处理，处理结束至无醇味，回收液中含有叶绿素和鞣质成分，加入CaCO3吸附除去，充分搅拌2h，产生沉淀离心去除。留取上清液用浓HCl调酸碱度直至pH=2，静置12h，离心，再去掉上清液，即获取半枝莲黄酮类化合物[6]。

2 SBF类化学成分

黄酮类化合物(flavonoids)又称黄酮体，是植物界比较常见的、分布广泛的一类天然活性成分。黄酮类成分在唇形科植物中存在较多，其他科植物还有玄参科、菊科、爵床科等也含量较多。半枝莲成分有黄酮类化合物和二萜化合物、生物碱、甾体、多糖类等，其中黄酮类化合物是半枝莲的主要活性成分。黄酮化合物有特殊的化学结构,其基本碳架为C6-C3-C6结构。据文献报道，半枝莲的产地分布广泛，综合测评各地SBF含量，不同产地半枝莲药材中总黄酮平均含量是3.95%。

半枝莲含有黄酮类成分大概分三种：黄酮、二氢黄酮和黄酮苷。科研表明，从半枝莲中分离并确定结构的黄酮类成分有50种，其中28种黄酮，另外6种二氢黄酮和16种黄酮苷，科研工作者利用高效液相色谱法等色谱方法，应用硅胶、Sephadex LH-20等实验研究[7，8]，对半枝莲成分进行分离提取及含量测定，实验表明，半枝莲主要的黄酮类成分有野黄芩苷(scutellarin)、野黄芩素(scutellarein)、木樨草素(luteolin)、芹菜素(apigenin)、圣草酚(eriodictyol) 、汉黄芩素(wogonin)（图1~6）。从颜色、性状鉴别，野黄芩苷和木犀草素均为黄色针状结晶；野黄芩素，黄色无定形粉末；芹菜素，黄色粉末；圣草酚，白色无定形粉末；汉黄芩素，黄色针晶。

图1 野黄芩苷

图2 野黄芩素

图3 木樨草素

图4 芹菜素

图5 圣草酚

图6 汉黄芩素

3 SBF药理活性

3.1 防治AD作用

AD发病机制众多，学术界有四种主流观点。一是β-淀粉样蛋白(amyloid beta-protein，Aβ)聚集积累产生老年斑诱发神经毒性，二是神经元内异常磷酸化tau蛋白成对螺旋丝导致神经元纤维缠结，三是脑神经元和突触丢失，四是线粒体功能等障碍。此外，生理病理特征还有脑葡萄糖代谢下降、胶质细胞激活和神经炎症等。

SBF具有抑制细胞凋亡、改善认知能力。细胞凋亡的调节根据其启动过程分为三个通路，其中之一是线粒体凋亡通路。郭可等[9]利用注射复合Aβ的方法模拟大鼠记忆障碍，研究发现SBF与细胞凋亡相关联。SBF在线粒体凋亡通路的调控是通过线粒体对Cyt-C的释放下调及抑制Apaf-1、Caspase-9和Caspase-3的表达而实现的。细胞基因表达的微观领域表明，SBF具有抑制细胞凋亡作用。张艳平等[10]通过双侧颈总动脉结扎方法建立沙土鼠拟脑缺血模型，发现大剂量SBF可通过下调海马区nogo-A的表达，显著改善沙土鼠的认知能力。

体内外的研究已经证实SBF对学习记忆障碍有改善作用,对神经损伤有保护作用，对 NFT 异常增多有抑制作用。tau蛋白磷酸化与AD关系表明，AD患者大脑中tau蛋白含量高于正常人，是AD患者大脑中正常tau蛋白含量降低和异常tau蛋白含量增加而引起。SBF对复合Aβ诱导大鼠脑内Tau蛋白多点位磷酸化起到调控作用。马帅等[11]通过大鼠体内实验研究证明，在37天的实验中，35、70和140mg/kg的SBF对复合Aβ诱导大鼠脑内tau蛋白多点位磷酸化水平产生抑制作用，作用机制是抑制tau蛋白多位点过度磷酸化，对tau蛋白Thr205和Ser214显著抑制,调控海马Thr212位点磷酸化tau蛋白表达的水平。樊琪等[12]在关于Aβ25-35对N2a细胞损伤和tau蛋白异常磷酸化及SBF干预机制方面的研究中，通过体外拟AD模型得出结论,SBF对AD的治疗有指导性作用，其作用机制是通过降低PKA活性和增加PP-1活性来完成的。通过调控PKA或者PP-1来抑制Aβ25-35所致的N2a细胞tau蛋白磷酸化水平的升高,同时能够减轻 Aβ25-35对N2a细胞的损伤，下调Ser199、Ser214、Ser404、Thr231和Thr205这些位点的tau蛋白过度磷酸化。蔡红玲等[13]通过小鼠实验得知，SBF对损伤脑神经瘤细胞具有保护功能，发现SBF能有效对抗Aβ25-35诱发的神经毒性。作用机制：SBF通过调节 GSK-3β的活性抑制tau蛋白 Ser404、Ser214位点磷酸化，而SBF 降低tau 蛋白 Ser202、Ser199和Thr23位点的过度磷酸化可能是通过影响其蛋白激酶引起的。另外，SBF抑制大鼠脑内NFT沉积调节机制研究表明，可能与抑制GSK3β活性、增加PP2A活性、降低tau蛋白磷酸化相关。AD伴随老龄化社会逐年增多，研究发现，Aβ25-35对细胞的毒性是AD发生发展的因素之一，减少脑内β淀粉样蛋白的数量累积,可显著改善AD的症状。

SBF对脑内神经纤维缠结有抑制作用。AD最主要的发病机制有两个，一是细胞外沉淀型Aβ引起的老年斑，二是细胞内tau蛋白磷酸化导致神经纤维缠结。侯晓婵等[14]实验表明，SBF化合物对复合Aβ诱导的脑内β-淀粉样蛋白的异常生成有明显抑制作用，对β/γ-分泌酶的表达有一定调节作用，此研究结果证明SBF对脑内神经纤维缠结有抑制功效。

SBF能降低神经元的损伤,对神经元有保护作用。吴晓光等[15]实验发现，SBF治疗明显改善了由复合β-淀粉样蛋白引起的大鼠记忆障碍和神经元损伤，包括海马神经元的丢失或固缩、大脑皮层丘状坏死等病理表现，为研究AD治疗药物提供了一定理论基础。有研究发现，SBF 作用机制对Aβ25-35引起大鼠大脑皮层星形胶质细胞的一氧化氮合酶(NOS)、热休克蛋白70(HSP70)及载脂蛋白 E(apoE)蛋白表达的过程产生了一定调控作用，同时，对损伤星形胶质细胞有保护作用[16]。张立波等[17]用大鼠MCAO建模，研究SBF抑制PIP1/PIP3通路对细胞程序化凋亡的机制，证明SBF能降低神经元的损伤，对脑神经元有保护作用。沈宏友等[18]实验表明，SBF治疗脑缺血再灌注损伤的机制与调控 c-fos 和 Bax 表达的下调、调控 Bcl-2表达的上调可能相关，从而达到保护神经细胞损伤的目的。因检测指标有限，研究周期较短，此实验仅从凋亡角度来分析问题，SBF减轻脑缺血的作用机制是否还有其他途径，需要进一步的研究。吴晓光等[19]应用了水迷宫试验法验证实验结果，采用了TUNEL法检测神经细胞凋亡，建立对照组与SBF3种剂量组开展研究，对比结果表明，SBF对因复合Aβ损伤所致的大鼠脑神经元功能障碍起到了抑制作用。作用的机制是调控了ULK1/2复合物的活性，对此活性的调控，一方面是通过对AMPK蛋白的激活，另一方面是通过对 mTORCL蛋白表达的抑制来实现的，最终表明，SBF降低了神经细胞凋亡。此实验对AD的治疗有参考价值。

3.2 抗氧化作用

实验研究表明，SBF类化合物能延缓细胞衰老的进程。陈红梅等[20]研究发现，SBF提取物对DPPH自由基和羟自由基均有一定的消除能力，有较强的还原性，可以作为新型抗氧化剂。周溦等[21]研究发现，SBF对秀丽线虫和人脐静脉内皮细胞具有抗氧化作用，能有效延缓秀丽线虫衰老，明显延长线虫的寿命。实验在酶的活性和基因水平上进行作用机制探讨，SBF在秀丽线虫和人HUVECs中增强相关酶的生物活性，调控细胞的抗衰老基因daf-16及sir-2.1的表达。SBF显著消除了体内活性氧自由基，显著去除体内自由基，具有明显抗氧化能力，能有效延缓衰老。此实验显示出SBF有抗氧化作用，为开发SBF等天然抗衰老药物提供了有力参考。

3.3 抗癌作用

任守雷等[22]实验研究发现，SBF能抑制人肺腺癌A549细胞的异常增多，调节细胞凋亡及抑制A549细胞迁移，并研究了有关肺癌治疗方面的机制。赖昌威[23]通过体外实验进行SBF抗肿瘤活性研究，结果显示白花蛇舌草和半枝莲中黄酮类成分与抗肿瘤药效紧密关联，黄酮部位是抑制杀伤 SGC-7901 的主要有效部位，具有较好的抗肿瘤作用。自噬作为细胞中溶酶体的降解途径之一，有利于细胞内分子和细胞器的重复利用。诱导细胞自噬即是 II 型程序性细胞死亡，可以改善肿瘤生长的微环境，抑制肿瘤转移扩散，是治疗肿瘤的重要机制。另有研究表明，SBF抗肿瘤机制可能是通过诱导恶性黑色素瘤细胞自噬来抑制胞磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路的活化而发挥作用。

半枝莲抑制卵巢癌细胞的体外实验结论表明，SBF通过线粒体途径抑制卵巢癌A2780细胞增殖并诱导细胞凋亡，此外，A2780细胞的迁移活性被显著抑制，半枝莲对卵巢癌细胞迁移的抑制作用可能与基质金属蛋白酶-2/9表达下调有关。这些发现有助于卵巢癌的治疗。陈明等[24]将B16-F1细胞系接种于小鼠，建立灭瘤模型，发现SBF可抑制NLRP3炎症体的表达，肿瘤坏死面积明显增加，炎症反应明显减轻，诱导肿瘤细胞自噬。郑晓等[25]研究发现，基于肿瘤衍生的甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、核因子kB配体受体激活剂(RANKL)及骨保护素(OPG)是促进乳腺癌骨转移溶骨性过程的主要因素。证明 SBF对乳腺癌骨转移存在一定的抑制作用，这预示着一种新的治疗方法。科研发现，免疫调节效应是针对癌症的免疫反应的重要治疗措施。

3.4 降糖降脂作用

SBF可以有效调节糖脂代谢紊乱，降低 II 型糖尿病血糖。有研究发现[26]SBF能改善大鼠糖尿病模型的糖脂代谢和血液流变学。SBF明显降低血糖水平，下调低密度脂蛋白、胆固醇、甘油三酯指标，可显著升高高密度脂蛋白，显著提升胰岛素含量，降低胰岛素抗体和糖化血清蛋白水平，对于全血低切、中切、高切粘度起到降低作用，对其他血液成分如血浆粘度、红细胞压积、血沉水平也起到降低作用。

3.5 抗病毒及抑菌作用

周凌凌等[27]观察半枝莲水煎液和醇提液对乙型肝炎病毒转染人肝癌细胞株2.2.15细胞的影响，发现半枝莲醇提液对乙肝病毒的抑制作用最显著，半枝莲醇提液中主要成分是黄酮类化合物。半枝莲水煎液、醇提液的半数毒性浓度分别是30.00mg/mL、21.62mg/mL。此实验为SBF作为临床抗病毒药物提供一种选择。郑丽娟等[28]分析了不同提取方法获得的半枝莲粗提物对体外细菌活性的抑制效果，半枝莲粗提取物主要成分是黄酮类化合物，结果表明，各粗提物对于耐药细菌具有普遍抑菌效果，半枝莲具有光谱的抗菌活性，抑菌浓度普遍达到2mg/mL，其中对耐药金葡菌效果最为显著。

4 临床应用

半枝莲在很多中医处方及中成药中是传统中药。比如中成药复方肾炎片是由益母草、丹参、半枝莲等15味中药组成。多年的临床观察表明，复方肾炎片对糖尿病(diabetes melli-tus, DM)患者有较好治疗效果[29]。运用半枝莲、白花蛇舌草治疗恶性肿瘤。半枝莲、白花蛇舌草常配伍使用，共同抗肿瘤。在抗肿瘤的机理中，两药起到相互协调、协同增效的作用，现代药理研究证实二者对多种恶性肿瘤有显著抑制作用。半枝莲具有抗肿瘤作用，半枝莲作为抗癌中药被广泛应用于各种肿瘤的治疗，含半枝莲的抗肿瘤复方包括藤龙补中汤、肠复方等。临床研究显示，藤龙补中汤治疗大肠癌，可抑制肿瘤的生长，降低化疗不良反应，改善患者临床症状，延长寿命。半枝莲相关专利产品已发展上市，如安康欣胶囊，适用于肺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌等肿瘤的治疗，可抑制肿瘤生长，杀伤肿瘤细胞。近年来，SBF在临床上对多种肿瘤治疗效果显著,也是研究热点方向。关于半枝莲及其黄酮在临床的许多药用价值还需进一步研究。

5 结语

综上所述，半枝莲作为常用中药，半枝莲中的黄酮化合物作为主要活性成分之一，具有广泛临床开发前景。关于SBF类化合物的提纯制备方法也取得了一定的成果。近年来，科研工作者对SBF化合物在防治AD、抗氧化、抗肿瘤、保护神经元、降糖降脂、抗病毒及抑菌等药理活性方面进行了大量的探索研究。但对SBF药理活性还需要进一步研究，目前缺乏更多治疗AD、糖尿病、抗肿瘤等疾病相关SBF药品应用于临床。对半枝莲提取的黄酮成分及其药理学研究还需更加深入，以明确SBF成分药理作用机制，从而为植物药开发提供基础理论和参考借鉴。