miR398和miR408 对UV-B胁迫下拟南芥幼苗的影响

陕永杰,张美萍，冀丽蓉,李丹,张莉,沈振国

1.山西师范大学地理科学学院，山西 临汾，041000；2.山西师范大学生命科学学院，山西 临汾，041000；3.南京农业大学生命科学学院，江苏 南京，210094

MicroRNAs (miRNAs)是一类参与 mRNA 转录后调控的非编码单链小 RNA，在植物器官形成、发育与分化信号通路及基因表达中均有重要作用[1].逆境胁迫可诱导某些 miRNA 表达并在多种胁迫中发挥重要的调控作用[2，3].Sunkar等发现，拟南芥幼苗的 CSD1 和 CSD2 在高浓度Cu2+和高浓度 Fe3+下的表达水平受miR398调控，消除氧化基团，减轻植物受胁迫的损伤[3～5].miR408 对低温、干旱、重金属等多种非生物胁迫均有响应[6，7].miR398 和miR408 虽可对植物遭遇的多种胁迫产生应答，但其应答机制有待研究.

近年来，随着氯氟烃化合物等大量使用，臭氧层加速损耗，臭氧层的减少导致到达地表面的UV-B(波长 280 nm～320 nm)辐射增加[8].研究表明，增强UV-B 辐射影响了植物的生长发育、生理生化过程、细胞活动、分子调控机制等均产生显著变化[9～11].UV-B辐射引起的光氧化会对光合系统造成损伤，引起光抑制[12～14].UV-B 辐射对PSⅡ的影响要远大于对PSⅠ的影响[15,16]，损伤了捕光系统和耗散保护机制，破坏了植物的光合系统，使其光合效率下降[17].UV-B胁迫下，膜脂过氧化及清除自由基的能力加剧.为应对胁迫，植物形成了一系列防御保护机制[18].Jia等在欧洲大叶杨中研究了24个miRNA发现，在 UV-B 辐射下，13个miRNA上调表达，11个下调表达[19,20].本研究通过研究miR398 和miR408 对 UV-B 辐射胁迫的响应，为作物育种提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料及培养 选用哥伦比亚(Columbia-0)生态型野生拟南芥作为对照组，过表达miR398 和过表达miR408 拟南芥均购于拟南芥种子资源库.用1 %的次氯酸钠进行种子消毒，无菌水清洗，播种于MS培养基上，低温(4 ℃)48 h，23 ℃光照培养箱中培养，湿度为70 %，光照时间为 16 h，暗处理8 h，待拟南芥长出两片真叶时移栽到土壤基质(泥炭土∶蛭石∶珍珠岩=1∶1∶1)中，进行实验处理.

1.1.2 材料处理设置 共设置四个处理组，分别是正常光照下野生型拟南芥组(WT)，过表达miR398/miR408 拟南芥组(miR398/miR408)，UV-B 辐射下的野生型拟南芥组(WT-UVB)，UV-B辐射下的过表达miR398/miR408 拟南芥组(miR398-UVB/miR408-UVB).光照强度为 2 000 Lx，培养温度23 ℃，湿度为70 %，UV-B 辐射剂量为 10.08 kJ·m-2d-1，紫外灯光规格30 W，297 nm(南京华强生产)，各实验处理组设置如表1.

表1 各实验处理组的设置Tab.1 Setup of each experimental treatment group

1.2 方法

1.2.1 光合系统指标测定 移栽土壤培养 20 d 时进行指标测定，参考高俊凤的方法[21]，将各处理组的植物放在黑色罩中暗适应 30 min，选择正常生长的叶片，在不离体的条件下用叶夹夹住叶片，测定初始荧光F0，最大荧光Fm，按公式Fv=Fm-F0为可变荧光Fv，Fv/Fm为 PSⅡ最大光化学效率，再测得Fm′、F0′、Fs，根据计算公式测得：非光化学淬灭(NPQ)及光化学淬灭系数qP，公式如下

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

1.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 采用氮蓝四唑光还原法测定SOD酶活性.称取 0.5 g 叶片，加入 2 mL 预冷的提取介质于冰浴中研磨成浆液，定容至10 mL，取 5 mL提取液 4 ℃，10 000 r/min 离心 15 min，提取上清液即为 SOD 粗提取液，测定560 nm 处的吸光度.

1.2.3 谷胱甘肽(GSH)含量的测定 采用 DINB 显色法测定 GSH 含量，取 0.5 g 新鲜植物叶片，加入 5 mL 5 % TCA，充分研磨均匀，15 000 r/min 离心 15 min，取上清液 1 mL，加入 5 mL 磷酸缓冲液(pH=7.7，0.15 mmol/L)，加入 30 μL DTNB，反应后，以 5 % TCA 为空白，于412 nm测定吸光度.

1.2.4 丙二醛(MDA)含量的测定 依照张志良的方法[22]，称取叶片 0.3 g，加入 2 mL 0.05 mol·L-1磷酸缓冲液，迅速研磨成浆液，加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸提取液，沸水浴中沸腾 10 min，冷却，离心，测定532 nm、600 nm、450 nm 处吸光度.

1.2.5 数据统计与分析 采用 SPSS 17.0 与 Origin 软件对实验数据进行 LSD 和 DUNCAN 显著性分析，并作图.测定的试验数据均选用P<0.05，从最高到最低标记 a、b、c、d.

2 结果

2.1 增强 UV-B 辐射对拟南芥各处理组叶绿素荧光动力学参数的影响

Fv/Fm表示 PSⅡ原初光能转化效率[23]，由图 1A 可知，正常生长情况下，野生型植株Fv/Fm高于过表达miR398 拟南芥，差异不显著(P>0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm显著下调 10.19%(P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著下调 16.18 % (P<0.05).表明UV-B 显著降低了拟南芥的原初光能转化效率，而miR398 的过表达更大程度上降低了植株原初光能转化效率，损害植株生长.由图 1B可知，正常光照下，野生型植株Fv/Fm高于过表达miR408 拟南芥，但差异不显著(P>0.05).UV-B 辐射处理后，过表达miR408 拟南芥显著下调 12.71%(P<0.05).表明 UV-B显著降低了拟南芥的原初光能转化效率，过表达miR408 进一步降低了植株的原初光能转化效率，影响了光合能力，损害植株生长.

图1 拟南芥各处理组光合参数 Fv/Fm 变化Fig.1 Changes of photosynthetic parameters Fv/Fm in Arabidopsis treatment groups

qN非光化学淬灭表示的是植物耗散过剩光能转化为热能的能力[24]，由图 2A 可知，正常光照下，野生型植株qN值低于过表达miR398 拟南芥，但差异不显著(P>0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥qN值显著上升 11.42%(P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著上升18.67%(P<0.05).表明在 UV-B 胁迫诱导下，miR398 基因调控拟南芥响应辐射，过表达miR398 拟南芥耗散过剩光能为热能的能力更强，不利于植株生长.由图 2B 可知，正常光照下，野生型植株qN值低于过表达miR408 拟南芥，差异不显著(P>0.05).UV-B 辐射处理后，过表达miR408 拟南芥显著上升 19.88%(P<0.05).表明在 UV-B 胁迫诱导下，过表达miR408 拟南芥耗散过剩光能为热能的能力更强，影响植株生长.

图2 拟南芥各处理组光合参数 qN 的变化Fig.2 Changes of photosynthetic parameters qN in Arabidopsis treatment groups

qP光化学淬灭反映光系统Ⅱ (PSⅡ)原初电子受体QA的还原状态，qP越大，表明 PSⅡ电子传递活性越大[25].由图 3A可知，正常光照下，野生型植株qP值高于过表达miR398 拟南芥(P>0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥qP值显著下降 12.26%(P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著下降 17.90%(P<0.05).表明 UV-B 胁迫会降低拟南芥的 PSⅡ电子传递活性，而过表达miR398拟南芥进一步降低 PSⅡ电子传递活性，影响植株生长.由图 3B 可知，正常光照下，野生型植株qP值高于过表达miR408 拟南芥，差异显著(P<0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥qN值显著下降 12.26%(P<0.05)，而过表达miR408 拟南芥显著下降 27.46%(P<0.05).表明在 UV-B 胁迫会降低拟南芥的 PSⅡ电子传递活性，而过表达miR408 基因的拟南芥进一步降低 PSⅡ电子传递活性，光合效率降低，影响植株生长.

图3 拟南芥各处理组光合参数 qP 的变化Fig.3 Changes of photosynthetic parameters qP in Arabidopsis treatment groups

以上结果表明，UV-B 胁迫叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm、qP数值降低、qN数值升高，降低光合效率，而过表达miR398 和miR408 降低 UV-B 胁迫下的叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm、qP数值、增加qN数值，降低光合作用效率，影响了植株生长发育.

2.2 增强 UV-B 辐射对拟南芥各处理组中抗氧化酶活性的影响

植物遭遇胁迫时，植物体调动抗氧化酶类(SOD酶、CAT酶、POD酶等的活性)和抗氧化物质(GSH、AsA 等)含量清除活性氧及氧自由基等，从而降低胁迫造成的细胞损伤.植物的防御能力与抗氧化能力具相关性.由图 4A 可知，正常光照下，野生型植株 SOD 酶活性高于过表达miR398 拟南芥(P<0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥 SOD 酶活性显著下降22.42 % (P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著下降 48.97 % (P<0.05).表明 UV-B 胁迫会导致拟南芥 SOD 酶活性降低，而表达miR398 基因的拟南芥进一步降低 SOD 酶活性，从而 影响植物自我修复，对生长造成影响.由图 4B 可知，正常光照下，野生型植株 SOD 酶活性高于过表达miR408 拟南芥，差异显著(P<0.05).过表达miR408 拟南芥显著下降 54.23 % (P<0.05). 表明 UV-B 胁迫会导致拟南芥 SOD 酶活性降低，而过表达miR408 基因拟南芥进一步降低 SOD 酶活性降低，从而影响植物自我修复，影响植物生长.

图4 拟南芥各处理组 SOD 酶活性的变化Fig.4 Changes of SOD content in Arabidopsis treatment groups

由图 5A 可知，正常光照下，野生型植株 GSH 含量高于过表达miR398 拟南芥(P<0.05). UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥 GSH 含量显著下降 42.86 % (P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著下降 50 % (P<0.05).表明 UV-B 胁迫会导致拟南芥 GSH 含量减少，而表达miR398 基因的拟南芥进一步降低 GSH 含量，细胞清除活性氧自由基的能力下降，降低植物防御能力.由图 5B 可知，野生型植株 GSH 含量高于过表达miR408 拟南芥(P<0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥 GSH 含量显著下降 42.86 % (P<0.05)，而过表达miR408 拟南芥显著下降 47.62 % (P<0.05).表明 UV-B 胁迫会导致拟南芥 GSH 含量减少，而过表达miR408拟南芥降低 GSH 含量，细胞清除活性氧自由基的能力下降，氧自由基的积累不利于植物的生长.

图5 拟南芥各处理组 GSH 含量的变化Fig.5 Changes of GSH content in Arabidopsis treatment groups

2.3 增强 UV-B 辐射对拟南芥各处理组中丙二醛含量的影响

植物在逆境胁迫下受到损害，这与活性氧积累导致植物膜脂的过氧化作用相关，而作为膜脂过氧化产物之一 MDA，其含量的变化可以反映膜系统受损程度.由图 6A 可知，正常光照下，野生型植株与过表达miR398 拟南芥中 MDA 含量无显著差异(P>0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥 MDA 含量显著上升 6.71 % (P<0.05)，过表达miR398 拟南芥显著上升 12.41% (P<0.05).表明 UV-B 胁迫导致拟南芥 MDA 含量升高，膜脂过氧化程度加深，而过表达miR408 拟南芥增加 MDA含量，损伤细胞膜.由图6B 可知，正常光照下，野生型植株低于过表达miR408 拟南芥中 MDA 含量(P<0.05).UV-B 辐射处理后，野生型拟南芥 MDA 含量显著上升 8.28 % (P<0.05)，过表达miR408 拟南芥显著上升 65.52 % (P<0.05).表明 UV-B 胁迫会导致拟南芥 MDA 含量升高，活性氧积累，膜脂过氧化程度加深，而过表达miR408 拟南芥的 MDA 含量增加，MDA大量积累对植物造成不可修复的伤害.

图6 拟南芥各处理组 MDA 含量的变化Fig.6 Changes of MDA content in Arabidopsis treatment groups

结果表明，UV-B 胁迫造成了拟南芥幼苗的 SOD酶活性、GSH 含量降低，MDA 含量上升，活性氧积累，而过表达miR398 和miR408 会进一步增加 UV-B 胁迫下的活性氧含量，降低植物清除氧自由基的能力，影响植物抵抗辐射逆境胁迫，损害植株生长发育过程.

3 讨论与结论

近年来，由于臭氧层减薄导致到达地表的 UV-B 辐射增强影响了植物正常生长，使得农作物产量减少[26].增强UV-B 辐射对植物的光合能力下降、抗氧化系统及 DNA 造成不同程度的损伤.强烈的紫外辐射还可破坏植物叶片中的叶绿体超微结构，光合色素合成受到抑制，最终导致光合速率的下降，影响植物生长发育[27].研究发现，受 UV-B 辐射胁迫的野生型拟南芥与正常光下的拟南芥相比，叶绿素的荧光动力学参数Fv/Fm值下降，光能转化率降低，qN非光化学淬灭系数升高，植物耗散过剩光能转化为热能的能力增强，qP造成 PSⅡ电子传递活性下降，这表明 UV-B 胁迫严重影响植物的光合作用过程，光合速率下降.此外，在 UV-B 胁迫等非生物胁迫下，植物体会产生大量活性氧，活性氧对细胞组织和生物大分子具有攻击性，少量活性氧可以作为激起植物胁迫响应和防御反应的信号分子，但过量活性氧容易造成细胞损伤.本研究发现，受 UV-B 辐射胁迫的野生型拟南芥与正常日光下的拟南芥相比，植物体内 SOD 酶活性降低，GSH 含量降低，过氧化产物 MDA 含量上升.这表明 UV-B 胁迫使得 SOD 酶活性降低和 GSH 含量减少，植物体内清除氧自由基的能力下降，造成了拟南芥体内活性氧的积累，最终导致膜脂过氧化程度加深，损伤细胞膜，影响植物生长.前人研究发现 UV-B 辐射胁迫通过对植株体中光受体的影响，致使光信号导入细胞核[28]，在相关作用元件下 miRNAs 表达发生改变，影响了植物的生长发育及器官形成等[29，30].此过程中，miRNAs 的表达模式响应了 UV-B 辐射胁迫.miR398 和miR408 受多种逆境胁迫诱导并参与多种胁迫的调控，如干旱、高盐、重金属胁迫等[3～5，7].

本研究发现miR398 和miR408 均响应 UV-B 辐射胁迫.过表达miR398 和miR408 会进一步降低 UV-B 胁迫下的叶绿素荧光动力学参数Fv/Fm、qP、增加qN，降低光合作用效率，影响植株生长发育.此外，过表达miR398 和miR408 拟南芥增加 UV-B 胁迫下活性氧含量，降低植物清除氧自由基的能力，影响植物抵抗辐射逆境胁迫，损害植株生长发育过程.这表明过表达miR398 和miR408 的拟南芥植株抗逆性更差，但miR398 和miR408对 UV-B 胁迫应答机制还不完善，有待进一步研究.