CD137信号调控内皮细胞间质转化促进小鼠心脑血管新生

翁嘉懿,马雪兴,李 渊,孙康云

(1.江苏大学附属医院心血管内科,镇江212000;2.苏州市立医院,南京医科大学附属苏州医院心血管内科,苏州215000)

血管新生是从原血管以出芽方式形成新生微血管，是动脉粥样硬化（atherosclerosis）易损斑块的特征性病变。内皮细胞间质转化（endothelium-mesenchymal transition，End-MT）是介导炎性细胞浸润、血管新生、影响动脉粥样硬化斑块完整性，从而诱发动脉粥样硬化易损斑块破裂并导致一系列急性心脑血管事件的关键因素，是远期心血管事件可靠的独立预测因子［1］。End-MT是内皮细胞在各种病理因素作用下向间充质细胞转化的过程，在该过程中内皮细胞逐渐失去其形态和功能，获得增殖、迁移和合成胶原等间充质细胞表型特点［2］。在炎性浸润、缺氧等因素刺激下，动脉粥样硬化斑块内发生End-MT的内皮细胞一方面可促进胶原-基质金属蛋白酶合成，促使斑块纤维帽变薄；另一方面内皮细胞失去特异性抗原，获得间质细胞抗原，同时其功能发生改变，获得较强的增殖、迁移能力，通过促进新生血管形成，导致斑块破裂和继发临床急性事件的发生［3］。近期研究结果证实：冠状动脉易损斑块内End-MT细胞数量及新生血管数量显著增加［4］。End-MT过程受多种刺激因素和Wnt信号通路调控，这些信号通路相互调节，从而激活多种转录基因，影响End-MT的发生和发展［5-6］。目前，End-MT的具体调控机制仍在研究中，可能与干预因素、微环境变化及调控血管新生的关键分子有关。

CD137属肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成员，在动脉粥样硬化不稳定斑块中高表达。CD137信号通路在血管新生及动脉粥样硬化进展过程中起着至关重要的作用［7］。CD137分子与其配体结合可作为共刺激分子，促进T淋巴细胞激活，进一步加速炎性因子释放而加重炎性反应，从而促进动脉粥样硬化进展。新近研究表明，CD137信号在动脉粥样硬化斑块形成中起重要作用，动脉粥样硬化斑块中存在CD137高表达，而CD137基因敲除小鼠的粥样斑块明显减少［8-9］。本课题组前期研究发现，CD137信号可以促进动脉粥样硬化斑块内新生血管的形成［10］。本研究在此基础上进一步观察CD137信号是否通过调控内皮细胞End-MT促进血管新生，即通过分别激动CD137信号和在抑制End-MT相关信号的基础上激动CD137信号，观察End-MT及内皮细胞管腔形成能力和动脉环血管新生能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要实验材料

SPF级别8周龄C57BL/6J雄性小鼠20只，体质量20～22 g，由江苏大学动物实验中心［SCXK（苏）2018-0012］提供，饲养于江苏大学实验动物中心［SYXK（苏）2018-0053］，根据实验动物相关管理规定进行操作和处理。动物实验经江苏大学动物福利伦理委员会批准（UJS-IACUC-2019102902）。CD137L重组蛋白、PCR上下游引物均由上海生工生物工程有限公司设计并合成；胎牛血清、高糖培养基（DMEM）、双抗、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）购 自 美 国PeproTech公司；兔抗鼠CD31、血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VECadherin）、成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein-1，FSP-1）、Wnt和肌动蛋白α（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体，以及内参GAPDH单克隆抗体均购自德国Cell Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自美国Invitrogen公司；Wnt信号抑制剂（IWR-1）购自安诺伦（北京）生物科技有限公司；RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；蛋白提取试剂盒和反转录试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；ECL化学发光试剂盒购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；基质胶购自武汉艾美捷科技有限公司；小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3购自美国标准培养物保藏中心；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；鼠尾Ⅰ型胶原购自德国Millipore公司；眼科手术器械购自北京中兴名业科技发展有限公司。

1.2 细胞及动脉环的培养

小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3［11］在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，然后置于37℃培养箱中，待细胞融合度为80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化后离心细胞，常规传代。

以颈椎脱臼法处死小鼠，取下胸主动脉后，置于质量浓度为2 g/L的Ⅱ型胶原酶中，并放入37℃培养箱中消化6～7 min以去除外膜。然后，将血管均匀地剪成约0.5 mm长的动脉环，放入无血清培养基中，在37℃培养箱中饥饿过夜。将预处理过的动脉环包埋入质量浓度为1 g/L的鼠尾I型胶原包被的96孔板中。96孔板在室温平衡10 min后，放入37°C培养箱孵育30 min。待胶原凝固后，加入含2.5%胎牛血清的DMEM 100μL/孔覆盖胶原表面，隔天换液。

1.3 实验分组及干预

细胞分组：将密度为2×105个/孔的bEnd.3细胞接种于6孔板，加入质量浓度为10 ng/mL的TNF-α刺激24 h进行预处理（诱导内皮细胞表达CD137）。按随机数字表法将预处理后的内皮细胞分为3组：（1）对照组，即培养基中加入质量浓度为10 ng/mL的TNF-α；（2）CD137刺激组，即培养基中加入质量浓度为10 ng/mL的TNF-α和质量浓度为5 mg/L的CD137抗体；（3）CD137抑制组，即培养基中加入浓度为200 nmol/L的IWR-1预处理细胞30 min后，再加入质量浓度为10ng/mL的TNF-α和质量浓度为5mg/L的CD137抗体。各组内皮细胞均置于37℃培养箱中培养，24 h后提取细胞蛋白或RNA备用。

动脉环分组：以鼠尾I型胶原（质量浓度为1 g/L）包被96孔板后，将动脉环按1个/孔包埋入96孔板，干预措施同上。

1.4 荧光定量PCR检测内皮细胞中CD31、VECadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA mRNA水平

经不同组处理后的细胞按照TRIzol法提取总RNA，并用反转录试剂盒反转录为cDNA，以反转录产物为模板，GAPDH为内参，用SYBR法检测CD31、VE-Cadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA的mRNA表达。PCR反应体系总体积为20µL反应，依次加入TaKaRa Taq Premix 10µL，上下游引物（浓度10nmol/L，引物序列见表1）各1µL，cDNA 1µL，ddH2O 7µL。PCR反应条件：预变性95℃5 min；变性95℃5 s，退火60℃30 s，40个循环；72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。

1.5 蛋白质印迹法检测CD31、VE-Cadherin、FSP-1、Wnt和α-SMA蛋白表达水平

各组内皮细胞分别按照RIPA裂解液及组织蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，分装后在－20°C保存待用。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，以350 mA恒流120 min转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。PVDF膜置于质量分数为5%的脱脂牛奶TBST缓冲液中，37°C封闭1 h，再分别加入相应的兔抗鼠CD31（1︰1 000）、VE-Cadherin（1︰1 000）、FSP-1（1︰1 000）、α-SMA（1︰1 000）、Wnt（1︰1 000）和GAPDH抗体（1︰3 000），4℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次，采用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1︰7 000），37℃孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL显色系统定影显色，使用LANE-1D图像分析软件对扫描灰度值进行相对定量分析。

1.6 Transwell迁移实验检测内皮细胞迁移能力

各组内皮细胞经预处理培养24 h后，消化收集细胞并计数，将收获细胞配制成1.5×106个细胞/mL的悬液，按1×105个细胞/孔加入Transwell小室上室（分组干预措施见1.3节）。12 h后取出小室，用棉签拭去聚碳酸酯膜上室侧细胞，下室侧细胞经固定，结晶紫染色，漂洗和拍照。每组设置3个复孔，实验重复3次。用Image-ProPlus 6.0软件计算每组下室侧细胞数量，分别取各组细胞数量的平均值，然后计算CD137刺激组与对照组及CD137抑制组与对照组细胞数量的比值。

1.7 内皮细胞管腔形成实验检测管腔形成能力

各组内皮细胞经预处理培养24 h后，消化收集细胞并计数，将收获细胞配制为1.5×105个细胞/mL的悬液，按1.5×104个细胞/孔接种于基质胶包被的96孔板，每孔覆盖100μL培养基（分组干预措施见1.3节）。24 h后拍照，通过Image-ProPlus6.0软件分析各组内皮细胞形成小管的长度及分支数量。每组设置4个复孔，实验重复3次以上。

1.8 小鼠主动脉环血管新生实验检测新生血管形成能力

以约80μL/孔鼠尾胶原包被预冷的96孔板，将动脉环包埋入液态基质胶。96孔板在室温平衡10 min后放入37°C培养箱孵育30 min，待胶原凝固后加入100μL/孔培养基（分组干预措施见1.3节）覆盖胶原表面，隔天换液。7 d后在倒置显微镜下观察动脉环新生微血管的数量和分支。每组设置5个复孔，实验重复3次以上。

表1实时荧光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.9 统计学方法

采用统计学软件SPSS 16.0进行统计学分析。计量资料以±s表示。两两比较采用t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠内皮细胞中CD31、VE-Cadherin、FSP-1、α-SMA、Wnt mRNA及蛋白表达水平

荧光定量PCR结果见图1A。与对照组比较，CD137刺激组的内皮细胞中CD31和VECadherin mRNA表达水平较低（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt表达水平较高（P值均＜0.05）；与CD137刺激组比较，CD137抑制组的内皮细胞中CD31和VE-Cadherin mRNA表达水平较高（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt表达水平较低（P值均＜0.05）。

蛋白质印迹法检测结果见图1B。与对照组比较，CD137刺激组的内皮细胞中CD31和VECadherin蛋白表达水平较低（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt蛋白表达水平较高（P值均＜0.05）；与CD137刺激组比较，CD137抑制组的内皮细胞中CD31和VE-Cadherin蛋白表达水平较高（P值均＜0.05），FSP-1、α-SMA和Wnt蛋白表达水平较低（P值均＜0.05）。

图1小鼠脑微血管内皮细胞中CD31、VE-Cadherin、FSP-1、α-SMA、Wnt mRNA及蛋白表达水平比较Figure 1 Comparison of the expression of CD31，VE-cadherin，FSP-1，α-SMA，Wnt at the mRNA and protein levels in cardio-cerebral endothelial cellsin thethreegroups

2.2 小鼠内皮细胞的迁移能力

Transwell细胞侵袭实验结果见图2A。CD137刺激组小鼠内皮细胞的迁移数量（1.21±0.13）多于对照组（1.00±0.00），CD137抑制组小鼠内皮细胞迁移数量少于CD137刺激组（0.83±0.07），差异均有统计学意义（P值均＜0.05）。

2.3 小鼠内皮细胞管腔形成能力

内皮细胞管腔形成实验结果见图2B。CD137刺激组的内皮细胞小管长度［（5.97±0.23）mm］大于对照组［（4.16±0.14）mm］，分支数量（31.58±1.43）多于对照组（24.11±1.10）个，差异均有统计学意义（P值均＜0.05）；而CD137抑制组内皮细胞小管长度［（2.03±0.09）mm］和分支数（7.68±0.93个）均小于CD137刺激组（P值均＜0.05）。

2.5 小鼠主动脉环血管新生情况

动脉环新生血管形成实验结果见图2C。小鼠主动脉环CD137刺激组的新生微血管数量（23.82±5.12）多于对照组（2.14±1.80），差异有统计学意义（P＜0.05）；而CD137抑制组新生微血管数量（3.16±1.10）少于CD137刺激组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2小鼠脑微血管内皮细胞的迁移能力、管腔形成能力和动脉环新生血管形成能力比较Figure2 Comparison of themigration and tubeformation abilities of cardio-cerebral endothelial cellsaswell asthe angiogenesis ability of mouse aortic rings in the three groups（the scale is 100μm）

3 讨论

冠状动脉粥样硬化性心脏病已成为人类死亡率最高的疾病之一，尤其是动脉粥样硬化诱发的急性心肌梗死的致残及致死率极高，已成为国民“头号杀手”。心脑血管疾病共同的病理基础是动脉粥样硬化。多项回顾性研究均显示在冠状动脉易损斑块内检测到新生微血管密度显著增加，绝大多数动脉粥样硬化斑块内的新生血管在炎性浸润、缺氧等因素刺激下，随着斑块发展而数量增多，为炎性介质浸润提供了通道，有助于斑块脂核形成及扩大，促进斑块内出血，更容易导致斑块破裂和临床急性事件如心肌梗死的发生［12］，这一点近期也被关于人类斑块血管新生的一项前瞻性研究结果所证实［13-14］。我们前期研究证实，伴随着CD137信号激活，小鼠动脉粥样硬化斑块内新生血管形成数量增加，内皮细胞增殖、迁移及管腔形成能力增加［15］，提示CD137信号可能促进动脉粥样硬化斑块内血管新生并导致斑块不稳定。

但是CD137信号如何促进动脉粥样硬化中血管新生的机制目前尚不清楚，血管新生过程受多种血管生成刺激和抑制因子的双重调控。Chen等对43例不同严重程度的冠心病患者的冠状动脉进行检测，发现冠状动脉病变严重程度与内皮成纤维细胞生长因子受体FGFR1表达缺失，Wnt信号转导增加、End-MT的发生程度密切相关［16］。动脉粥样硬化病变早期，Wnt信号通路激活导致End-MT增加，产生未完全成熟的成纤维细胞，促进End-MT过程引起的新生血管形成，并在动脉粥样硬化斑块晚期促进斑块的钙化，而当这一信号被抑制时，End-MT程度降低，新生内膜形成减少［17-18］。这些结果提供了强有力的证据：End-MT这一过程有助于动脉粥样硬化新生血管形成，进而促进病变发生和进展，更容易导致斑块破裂和继发临床急性事件的发生。

CD137信号是否通过End-MT调控动脉粥样硬化血管新生呢？现有的研究尚不能回答这个问题。故本实验分别从细胞和离体实验两方面分别观察激活CD137信号通路并抑制Wnt信号，观察对End-MT及新生血管形成的影响。在细胞实验中，我们前期实验已证实CD137信号激活，内皮细胞增殖、迁移、成管能力显著增强，可促进血管新生，但其中机制尚不明确。本实验中，我们发现激活CD137信号通路，伴随着内皮细胞形成管腔长度、分支数量增加，动脉环新生微血管数量增加，内皮细胞内Wnt信号激活，CD31、VECadherin内皮细胞表型蛋白表达减少，间充质细胞表型FSP-1和α-SMA表达增加。综合国内外研究进展及前期工作，我们提出CD137信号通路可能通过调控内皮细胞内皮-间质细胞转化促进血管新生的假说，为验证该假说，本研究通过Wnt信号抑制剂抑制End-MT相关信号通路激活，再次激活CD137信号，检测内皮细胞迁移及管腔形成能力，观察小鼠动脉环新生血管形成能力。结果显示，激活CD137信号，内皮细胞内内皮细胞表型CD31、VE-Cadherin表达下降，间充质细胞表型FSP-1和α-SMA表达增加，Wnt信号激活，同时内皮细胞增殖、迁移等管腔形成能力增加，形成小管长度及分枝增加，小鼠动脉环新生血管形成能力增加，不仅如此，抑制Wnt信号后，再刺激CD137信号，与CD137刺激组比较，内皮细胞内内皮细胞表型CD31、VE-Cadherin表达升高，间充质细胞表型FSP-1和α-SMA表达下降，同时内皮细胞增殖、迁移等管腔形成能力减弱，形成小管长度及分枝减少，小鼠动脉环新生血管数量显著减少。综上所述，本次研究结果提示，CD137信号通路通过End-MT介导新生血管的形成。然而，EndMT目前在体水平缺乏明确的功能学定义与生物学标志物，本研究在动物水平的研究中对End-MT的定义也较为模糊，内皮细胞标志蛋白与间充质细胞特异性蛋白的细胞表达定位有待进一步证实，CD137信号激活Wnt信号后是如何传递信息与相应靶基因结合促发End-MT的形成？CD137信号轴如何调控Wnt信号及其与该信号通路间的相互作用以及各自在诱发End-MT进程中发挥多大作用，其具体机制如何，均需要深入探讨。

综上所述，CD137信号通路可能通过End-MT促进小鼠动脉粥样硬化斑块内的血管新生。本实验为了解CD137-CD137L信号通路与新生血管形成的相关性提供了理论基础，也为预防和治疗动脉粥样硬化提供了新思路。