薏苡仁-白花蛇舌草-莪术治疗乳腺癌的网络药理学研究

孙杨，丘嫦，毛思颖

(广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510120)

0 引言

乳腺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，也位列中国女性恶性肿瘤发病率首位，并且一直呈现上升趋势[1]。随着乳腺癌早期诊断的进步和内分泌、靶向药物的蓬勃发展，发达国家20年来乳腺癌死亡率逐渐下降，但近年来下降趋势明显放缓[2]，很大原因是缺少能进一步改善生存的新药。既往乳腺癌药物的研发是建立在“单基因-单药物-单疾病”的逻辑基础上，但Hopkins指出疾病表型的体现大多是多基因网络作用的结果，很少由单基因单靶点决定，建议药物的研发要转换到“多成分多靶点”思路[3]，这与中医药复方理论有异曲同工之意，通过中药多个有效成分与疾病多个靶点的相互作用，形成关联网络，使病理条件下机体的多个非平衡状态调节到新的平衡状态，最终达到治愈疾病的目的[4]。因此，结合网络药理学的哲学原理，探索中医药治疗乳腺癌的多成分多靶点相关作用成为挖掘中医药疗效的新方法。

在中医药抗乳腺癌领域，全国名中医林毅教授深耕多年，结合地域及肿瘤特点，提出了乳腺癌的病因病机为“正气亏虚为本，气滞、血瘀、痰凝、邪毒内蕴为标，其中又以痰瘀互结在乳腺癌发病机制中占重要地位”[5]，祛邪药对以“薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”为主，具有岭南特色和良好疗效，通过网络药理学方法分析上述药对抗乳腺肿瘤的分子机制，可以为进一步进行基础研究提供方向。

1 材料和方法

1.1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”的活性化合物及作用靶点筛选

通过中医药系统药理学平台TCMSP寻找“薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”药对的活性化合物成分，筛选口服利用度(OB)≥30%且类药性(DL)≥0.18的具有较好成药性的活性化合物，进一步获得活性化合物所作用的蛋白质靶点，结合PubChem和已发表的文献报道补充活性化合物的已知靶点。通过蛋白质数据库UniProt规范靶蛋白所对应的人类基因名称。

1.2 乳腺癌的疾病相关靶点筛选

以“Breast Cancer”“Breast Carcinoma”“Breast Neoplasm“为关键词在GeneCards数据库、OMIM 数据库搜索乳腺癌的潜在靶点，在DRUGBANK数据库寻找乳腺癌治疗药物的作用靶点予以补充。GeneCards数据库中，Score值代表了基因与疾病关系的密切程度，因此，我们将聚焦主要矛盾原则，选取Score高的相关靶点。

1.3 构建药物活性成分-疾病靶点PPI网络

为明晰药物相关靶点与乳腺癌疾病靶点间的相互作用，将二者靶点取交集并绘制韦恩图。将交集靶点导入STRING11.0 数据库构建蛋白互作(PPI)网络，最小互相作用阈值设定为“highest confidence”(>0.9)，其余均为默认设置，得到 PPI 网络。将PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件行拓扑分析，根据介度、紧密度、连接度值，遴选“薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”治疗乳腺癌的核心靶点；通过MCODE插件对PPI网络进一步分析，得到核心蛋白质功能模块，分析核心模块参与的生物学进程。

1.4 靶点功能与通路的富集分析及药物成分-疾病靶点-信号通路网络构建

将“薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”治疗乳腺癌的靶点导入Metascape平台，设置P<0.01，进行GO和KEGG分析。将结果数据录入CytoScape3.7.2构建成分-靶点-通路网络图，展现其相互关系。

2 结果

2.1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”的活性化合物及作用靶点筛选

筛选出活性成分共12个，其中薏苡仁6个，白花蛇舌草5个，莪术2个，1个成分为薏苡仁、白花蛇舌草共有(见表1)。薏苡仁作用靶点44个，白花蛇舌草作用靶点260个，莪术作用靶点23个，合并去重后靶点187个。

表1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”活性成分基本信息

2.2 乳腺癌的疾病相关靶点筛选

在GeneCards数据库检索出乳腺癌相关靶点基因14630个，其Score值区间范围广(440.05-0.08)，我们选取了前1/16位 数 的 靶 点(Score≥21.22)共919个，从OMIM和DRUGBANK数据库分别找到496个和128个靶点，将上述靶点进行合并后去除重复值，最终得到1367个疾病靶点。

2.3 构建药物活性成分-疾病靶点PPI网络

将“薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”活性成分靶点与乳腺癌疾病靶点取交集，绘制韦恩图，筛选出二者的共同靶点95个(见图1)。

图1 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”成分靶点与乳腺癌靶点的韦恩图

将药物疾病共同靶点输入String在线数据库，获得PPI网络，将网络导入Cytoscape 3.7.2软件制作预测靶点互作图(见图 2)。该网络共有92个节点，374条边，平均度值为14.5，大于平均度值的靶点有13个(见表2)。其中排名前7位的TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF靶点的度值超过22，可能为薏苡仁-白花蛇舌草-莪术治疗乳腺癌的关键靶点。应用Cytoscape的MCODE插件来查找PPI网络中最重要的模块，即PPI中密度最高的区域，该模块由22个节点和64条边组成(见图3)，根据P值，保留核心模块5个最佳评分的生物学进程对其进行功能描述，主要涉及细胞黏附调节和凋亡方面(见表 3)。

表2 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”治疗乳腺癌核心靶点及其拓扑参数

表3 MODULE网络的生物学进程功能描述

图2 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”治疗乳腺癌的高置信度靶点互作网络

图3 PPI网络中的MODULE

2.4 药物与疾病交集靶点的富集分析及化合物-靶点-通路网络构建

通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，得出交集蛋白在细胞中的功能及所涉及的信号通路等。薏苡仁-白花蛇舌草-莪术主要参与的生物学过程包括凋亡信号通路、有毒物质的应答、细胞死亡的正向调节等(见图4 A)，参与的主要通路有肿瘤通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路等(见图4 D)。运用CytoScape3.7.2构建薏苡仁-白花蛇舌草-莪术的药物成分-靶点-通路网络(见图5)，深蓝箭头代表通路，浅蓝六边形代表靶点，中央圆形为药物成分，主要的药物活性成分有：槲皮素、β-谷甾醇、双去甲氧基姜黄素。

图4 药物抗癌靶点的富集分析

图5 “薏苡仁-白花蛇舌草-莪术”治疗乳腺癌的“化合物-靶点-通路”网络

3 讨论

薏苡仁、白花蛇舌草、莪术是林毅名中医治疗乳腺癌的常用攻邪药组，是结合岭南多湿特点及乳腺癌“痰瘀互结”的病理本质而配伍，有健脾渗湿、清热解毒、破血散结的作用。这三种药物中具备多种抗肿瘤作用的有效成分，其中，槲皮素、β-谷甾醇、双去甲氧基姜黄素等成分与乳腺癌的关系更为密切。有研究证实，槲皮素可通过Akt-mTOR途径介导的自噬诱导抑制细胞迁移和糖酵解来抑制乳腺癌的进展[6]，此外还具有抗炎，抑制血管生成等抗肿瘤作用[7]。β-谷甾醇能有效削弱乳腺癌MCF7诱导肿瘤的生长[8]，机制是通过抑制PI3K，p-Akt，Bcl-2家族成员和其他参与PI3K-Akt介导的线粒体信号传导途径的因子表达。双去甲氧基姜黄素可通过调节p53/p21和p16/Rb途径诱导ROS积累来抑制MCF-7细胞活力[9]。

TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF是药对的关键靶点。众所周知，TP53是抑癌基因，参与调控细胞周期进程、维护DNA和基因组完整性、DNA损伤后的修复和凋亡。而AKT是乳腺癌重要的驱动基因，激活后可催化100多种底物，参与调控乳腺癌的增殖、生存、迁移和转移等方面，AKT1作为AKT的主要亚型之一，主要起促进乳腺肿瘤发生的作用，具体机制是通过细胞周期蛋白(例如p21，p27和cyclin D1)增加细胞增殖，通过P53抑制细胞凋亡[10]。MAPK1(ERK2)有促进肿瘤发生发展及引发耐药的作用，可被雌激素快速激活[11]，雌激素相关受体γ蛋白水平受ERK/MAPK激活状态的影响，如ERK靶点突变可削弱了ERRγ驱动转录活性，引起他莫昔芬的耐药性[12]。雌激素受体能够调节AP-1响应基因转录而无需直接与DNA相互作用，与Fos/JUN家族成员之间通过蛋白质相互作用产生crosstalk，从而促进肿瘤增殖[13]。TNF、白介素-6 (IL-6)等细胞因子存在于肿瘤微环境和肿瘤转移部位中，已被报道与乳腺癌的发生有关[14]。

薏苡仁-白花蛇舌草-莪术治疗乳腺癌的主要信号通路，除肿瘤通路外，AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路与炎症氧化应激关系密切。如AGEs与RAGE的结合可以增加ROS水平，进而激活MAPK/NF-κB信号通路，产生IL6、TNF等炎症因子，延长导致肿瘤升高的炎症，增加癌症的发展[15]。流体剪切应力(FSS)同样可以通过ROS操纵细胞信号通路引起炎性因子释放，促进癌细胞的生长和存活，细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路调控癌细胞的细胞周期和增殖，是研究最多的FSS相关癌症病理通路之一[16]。

本研究通过网络药理学方法，对薏苡仁-白花蛇舌草-莪术治疗乳腺癌的作用机制进行了初步探讨。结果显示，薏苡仁-白花蛇舌草-莪术可通过槲皮素、β-谷甾醇、双去甲氧基姜黄素等多种活性化合物，作用于TP53、AKT1、MAPK1、JUN、RELA、IL6、TNF等靶点，调控肿瘤通路、AGERAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、MAPK信号通路等等多条通路，实现对乳腺癌的治疗，体现了其作用多成分、多靶点、多通路的特点。本研究不足之处在于仅能以已知类药性成分数据进行生信分析，后续还要在此基础进行动物或细胞实验验证，进而明晰药物治疗疾病的靶点及机制。