2型糖尿病周围神经病变患者血清miR-155水平变化及相关研究

朱珠，黄勇

糖尿病周围神经病变(DPN)是以自发性疼痛、感觉减退为主要特征的糖尿病微血管的常见并发症，若未及时诊治可导致感染、破溃甚至截肢[1-2]，因此DPN的早期诊疗具有重要的临床价值。DPN的发病机制目前未明，大量证据[3-4]显示miRNA的异常表达参与了DPN的起病，并与DPN的病情和转归密切相关。最新研究[5]发现，miR-155可降低DPN大鼠坐骨神经的运动和感觉传导速度，且将其沉默后检测到坐骨神经损伤明显缓解，从动物层面提示了miR-155与DPN的可能关联。然而，miR-155与DPN的临床研究目前未见报道，其临床应用仍待评估。基于此，本文以DPN患者为观察对象，观察miR-155水平变化，探讨其临床诊疗价值同时分析其与TNF-α、IL-1β相关性，以期为DPN的早期诊疗提供更多临床证据，并进一步揭示疾病的可能机制。

1 对象与方法

1.1 对象 收集2017年1月至2019年12月在丹阳市人民医院内分泌科住院的2型糖尿病(T2DM)患者。所有病例的诊断均符合T2DM诊断标准[6]，并根据其是否合并DPN，将其分为T2DM不伴周围神经病组(NDPN组)和T2DM伴周围神经病变组(DPN组)，DPN组均符合DPN诊断标准[7]并经EMG检查证实。入组标准：(1)年龄≥18周岁；(2)1个月内未进行抗炎、营养神经等治疗。排除标准：(1)脑卒中、CNS感染、癫痫等；(2)合并有心血管、肝、肾等严重原发性疾病，精神病患者；(3)合并有肿瘤、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、贫血者；(4)近2周有发热、感冒及其他感染性病史。共纳入160例T2DM患者，其中NDPN组86例，男54例，女32例；DPN组74例，男45例，女29例；两组性别构成具有可比性(P>0.05)。本研究通过了丹阳市人民医院伦理学委员会审查，所有受试者知情同意并均签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-155提取和相对表达测定 所有入组患者于次日清晨留取空腹静脉血5 ml，不抗凝自然状态静置30 min，3 000 r/min离心10 min后留取上清液放置于-20 ℃环境进行保存。所有操作按照miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书要求提取miRNA。根据miR-155引物反转录出对应的cDNA，并采用实时荧光定量PCR测定miR-155表达量。PCR反应条件：92 ℃ 15 min，(90 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)×5个循环，(95 ℃ 20 s，61 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s)×40个循环。所有引物由上海生工生物工程公司合成。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法分析miR-155表达数值相对水平情况并记录数据。

1.2.2 血清生化指标及TNF-α、IL-1β检测 所有受试者入院后次日清晨抽取患者空腹静脉血5 ml，不抗凝自然状态静置30 min，3 000 r/min离心10 min后留取上清液，使用生化分析仪检测血清三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖、肌酐、尿素氮同时检测糖化血红蛋白并记录数据。DPN组患者进行血清TNF-α、IL-1β测定，采用 ELISA法并按照试剂盒中说明书的要求检测并记录。

1.2.3 多伦多临床评分系统(TCSS)评估 所有入组的DPN患者行多伦多临床评分系统(TCSS)评估[8]，总分19分，由两位经验丰富的内分泌科医师执行并记录。

2 结 果

2.1 NDPN组与DPN组一般资料比较 见表1。与NDPN组相比，DPN组患者年龄、体重指数、空腹血糖、糖化血红蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白和TCSS评分均显著升高(均P<0.05)。两组间性别、吸烟史、高血压病史、胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白、肌酐和尿素氮水平差异均无统计学意义(均P>0.05)。

表1 NDPN组及DPN组一般资料的比较[x±s,例(%)]一般资料NPDN组(n=86)DPN组(n=74)P值年龄(岁)60.89±8.1364.72±7.270.000性别(男)54(62.79)45(60.81)0.797吸烟史38(44.19)38(51.35)0.366高血压58(67.44)52(70.27)0.700收缩压(mmHg)148.76±17.22143.86±14.770.057舒张压(mmHg)80.67±10.2582.67±12.770.273体重指数(kg/m2)25.01±2.3225.84±2.510.032空腹血糖(mmol/L)6.17±1.216.73±0.970.003糖化血红蛋白(%)6.97±0.787.23±0.460.012糖尿病病程(年)6.75±5.339.67±7.660.000血脂异常66(76.74)56(75.68)0.871胆固醇(mmol/L) 3.62±0.73 3.77±0.770.208三酰甘油(mmol/L)1.76±0.681.62±0.510.148低密度脂蛋白(mmol/L)2.27±0.692.55±0.580.007高密度脂蛋白(mmol/L)1.19±0.201.22±0.330.481尿素氮(mmol/L)5.66±1.315.87±1.720.382肌酐(μmol/L)74.81±14.3672.68±12.850.252TCSS评分(分)1.54±1.4610.29±2.870.000 注:1 mmHg=0.133 kPa

2.2 NDPN组与DPN组血清miR-155水平比较 NDPN组患者血清miR-155相对表达量(6.48±0.96)明显低于DPN组(7.52±1.01)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 DPN组血清miR-155与TCSS量表评分的相关性分析 见图1。进一步对DPN组血清miR-155与TCSS评分行相关分析显示，血清miR-155水平与TCSS评分呈正相关(r=0.603,P<0.01)。

图1 DPN组血清miR-155与TCSS量表评分的相关性分析散点图

2.4 多因素Logistic 回归分析 将年龄、体重、空腹血糖、糖化血红蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白、TCSS评分和血清miR-155水平纳入多因素Logistic回归分析结果显示，年龄(X1)、糖化血红蛋白(X2)、糖尿病病程(X3)、TCSS评分(X4)和血清miR-155(X5)均为DPN危险因素，差异有统计学意义(均P<0.05)(表2)。据此构建的Logistic回归方程为：Z=1/[1+e-(-6.015+0.492*X1+0.769*X2+0.817*X3+0.665*X4+0.743*X5)]，Hosmer and Lemeshow Test检验P=0.086，显示回归模型拟合度较好。似然比检验χ2=97.143，P<0.001，模型有统计学意义。

表2 DPN的多因素Logistic回归分析变量βWald χ2值OR值95%CI P值年龄0.49215.3591.6351.307～1.912 0.001糖化血红蛋白0.76917.6122.1581.924～2.3150.005糖尿病病程0.81712.5692.2642.015～2.4770.003TCSS评分0.6659.0171.9441.692～2.2860.018miR-1550.74312.7552.1021.995～2.2030.009

2.5 血清miR-155诊断DPN的ROC曲线评估 为进一步评估miR-155应用于DPN患者的诊断效能，对血清miR-155进行ROC曲线分析，其曲线下面积0.836，敏感性88.9%，特异性82.5%(图2)。

图2 血清miR-155的ROC曲线

而联合年龄、糖尿病病程、低密度脂蛋白、TCSS评分和血清miR-155构建的ROC曲线曲线下面积0.912，灵敏性95.6%，特异性89.6%(图3)。

图3 联合分析的ROC曲线

2.6 DPN患者血清miR-155和TNF-α、IL-1β的相关性分析 DPN组血清TNF-α检测值为(95.19±18.77)pg/ml，IL-1β为(19.03±6.29)pg/ml；分别与血清miR-155行相关性分析结果见图4、图5。血清miR-155分别与TNF-α、IL-1β呈正相关(r=0.675,r=0.701；均P<0.01)。

图4 血清miR-155与TNF-α的相关性分析散点图

图5 血清miR-155与IL-1β的相关性分析散点图

3 讨 论

DPN的发病机制十分复杂，包含慢性炎症反应[9]、神经营养紊乱[10]、氧化应激[11]等多重病理生理过程，在多种因素共同作用下导致了DPN的发生。近年来，miRNA与DPN研究成为领域内关注重点。miR-155是miRNA的重要成员，既往研究[12-13]多集中于肿瘤、类风湿关节炎等领域。随着研究的深入，Khamaneh等[14]发现，糖尿病大鼠肾、心脏、主动脉、和坐骨神经的miR-155表达水平明显低于正常大鼠，其特征性部位的表达降低提示miR-155可能与糖尿病并发症的发生存在关联。Chen等[5]则通过对DPN大鼠研究发现，DPN大鼠miR-155抑制后增加了坐骨神经的运动和感觉传导速度、增强血管生成并减轻炎症反应，从动物层面证实了miR-155对坐骨神经存在损伤作用。本研究显示，DPN患者血清miR-155水平较对照组明显增高，与动物层面证据一致，提示miR-155的增高与DPN的起病密切相关。而进一步相关性分析显示，miR-155与TCSS评分呈高度正相关，提示miR-155或可用于DPN患者病情严重程度的评估，具有良好的临床实用价值。

本研究结果显示，DPN组年龄、体重指数、空腹血糖、糖化血红蛋白、糖尿病病程、低密度脂蛋白和TCSS评分均较NDPN组显著升高，与既往向鹏月等[15]报道具有一致性，进一步佐证了DPN起病机制的复杂性。多因素Logistic回归分析则显示，年龄、糖化血红蛋白、糖尿病病程、TCSS评分和血清miR-155五项指标具有统计学意义，且miR-155亦可作为DPN的独立危险因素。而miR-155的ROC曲线下面积达0.836，具有较高的灵敏性和特异性，提示血清miR-155可作为辅助DPN诊断的良好指标。同时，本文亦将Logistic回归筛选出的年龄、糖化血红蛋白、糖尿病病程、TCSS评分资料与血清miR-155联合纳入分析。据此构建的ROC曲线下面积为0.912，灵敏度和特异性均优于miR-155单一评估，显示miR-155应用于联合评估时具有更高的效能。而年龄、糖化血红蛋白、糖尿病病程、TCSS评分等资料在T2DM患者临床诊疗工作中易于收集，极大便利了DPN早期诊疗工作的开展。此外，鉴于DPN炎性损害机制已被广泛认可[9]，本文亦选取了TNF-α和IL-1β这两项经典炎性指标以评估miR-155与神经炎性的可能作用关系，而miR-155与二者较优的正相关系数亦高度提示miR-155可能通过影响炎性因子代谢参与了DPN的发生，这需要今后在细胞和动物实验进一步探讨。

综上所述，本文观察DPN患者血清miR-155的变化，进而评估其应用于DPN诊断的临床价值，并对其可能的作用途径进行初步探讨。结果显示，miR-155具有良好的独立诊断效能，且在结合年龄、糖化血红蛋白、糖尿病病程、TCSS评分分析后更具优势，可为T2DM患者DPN的诊断提供良好分析指标。