枳椇子总黄酮提取工艺优化及其抗氧化活性研究

谢三都，陈惠卿,2，张 颖，赵雅彬

（1.闽南科技学院生命科学与化学学院，福建 泉州 362332；2.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350001）

枳椇子（Hovenia acerba Lindl.）为鼠李科枳椇属植物，异名有枳枣、木蜜、拐枣等[1]。研究表明，枳椇子富含黄酮类物质、生物碱类、皂苷和糖苷类等活性成分[2]，具有解酒、保护肝脏、抗脂质过氧化、抗衰老等功效[3-5]。因此，枳椇子备受科研界关注。

黄酮类化合物属于自然界中分布较广的酚类物质，为植物生长过程中产生的一类次生代谢产物，主要包括黄烷-3-醇、花色苷和黄酮，是一种天然抗氧化剂[6-9]。黄酮类化合物难溶于水，不具挥发性，易溶于有机溶剂和稀碱液，常见的提取方法有醇提法、碱法、有机溶剂萃取法、微波辅助提取、超声波辅助提取等[10-12]。其中，醇提法具有产物杂质少、提取率高、对设备要求简单等优点[13-14]。本文以枳椇子为原料，采用醇提法提取黄酮类化合物，在考察乙醇浓度、料液比、浸提温度和时间对枳椇子总黄酮提取效果影响的基础上，应用正交试验设计优化其提取工艺条件；同时，以茶多酚为阳性对照，通过探讨枳椇子总黄酮对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果来评价其体外抗氧化性能，以期为进一步利用枳椇子资源提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

枳椇子：购于东南医药连锁店；芦丁标准品：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、邻二氮菲、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、七水合硫酸亚铁、30%双氧水、无水乙醇、对氨基苯磺酸、浓盐酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS)、过硫酸钾、茶多酚、盐酸萘乙二胺等均为分析纯：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

721型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；RV10型数显旋转蒸发仪：广州仪科实验室技术有限公司；LGJ-12型真空冷冻干燥机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；JSP-100型高速多功能粉碎机：浙江省永康市金穗机械制造厂；SHB-B95A型循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FA2004型电子天平：上海衡平仪器仪表厂；HWS-28型电热恒温水浴锅：齐欣科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳椇子总黄酮的提取工艺流程

枳椇子粉碎、过80目筛，40℃下烘干至恒重→乙醇溶液恒温浸提→提取液过滤除渣→滤液真空浓缩→浓缩液冷冻干燥→冻干品冷藏储存。

1.2.2 标准曲线的制作

以芦丁为标准品参照文献[15]绘制标准曲线，所得标准曲线如下：

如图1所示，芦丁标准曲线的回归方程为：y=1.239 4x+0.002 5，决定系数R2=0.999 5，说明芦丁标准溶液在质量浓度为0～0.5 mg/mL范围内有良好的线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 枳椇子总黄酮提取率的测定

参照“1.2.2”方法，准确称取一定量的枳椇子总黄酮冻干粉，溶于相应体积分数的乙醇溶液中，用25 mL的容量瓶定容，充分摇匀后常温静置30 min，同时以相应体积分数的乙醇溶液代替样品做空白试验。按以下公式计算枳椇子总黄酮提取率：

式中，C为提取液中总黄酮的浓度，mg/mL；V为样品溶液的体积，mL；N为稀释倍数；M为枳椇子粉末的质量，g。

1.2.4 枳椇子总黄酮提取工艺优化

1.2.4.1 料液比的筛选

准确称取0.5 g枳椇子粉末，分别按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）的比例加入体积分数为30%的乙醇溶液，在60℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的枳椇子总黄酮冻干粉溶于体积分数为30%的乙醇溶液中，按标准曲线试验方法测定枳椇子总黄酮提取率，重复3次。

1.2.4.2 乙醇体积分数的筛选

准确称取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例分别加入体积分数为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液，在60℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量枳椇子总黄酮冻干粉溶于相应体积分数的乙醇溶液中，按标准曲线试验方法测定枳椇子总黄酮提取率，重复3次。

1.2.4.3 浸提温度的筛选

准确称取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例加入体积分数为10%的乙醇溶液，分别在30、40、50、60、70、80、90℃下恒温水浴提取10 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的枳椇子总黄酮冻干粉溶于体积分数为10%的乙醇溶液中，按标准曲线试验方法测定枳椇子总黄酮提取率，重复3次。

1.2.4.4 浸提时间的筛选

准确称取0.5 g枳椇子粉末，按料液比1∶80（g/mL）的比例加入体积分数为10%的乙醇溶液，在50℃下分别恒温水浴提取5、10、15、20、25、30 min，抽滤除渣，滤液冷冻干燥；取一定量的枳椇子总黄酮冻干粉溶于体积分数为10%的乙醇溶液中，按标准曲线试验方法测定枳椇子总黄酮提取率，重复3次。

1.2.4.5 乙醇浸提法提取枳椇子总黄酮的正交试验设计

在单因素试验的基础上，以枳椇子总黄酮提取率为考察指标，探讨料液比（A）、乙醇体积分数（B）、浸提温度（C）和浸提时间（E）对枳椇子总黄酮提取效果的影响，采用五因素四水平正交试验设计表L16(45)优化枳椇子总黄酮的提取工艺条件，因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.5 枳椇子总黄酮抗氧化活性的测定

1.2.5.1 茶多酚溶液的制备

参照文献[16]中茶多酚溶液的制备方法，具体如下：准确称取1.00 g的茶多酚，用蒸馏水溶解后定容至500 mL，制备成2.0 mg/mL的茶多酚溶液，并稀释成所需要各浓度的茶多酚溶液，备用。

1.2.5.2 枳椇子总黄酮对羟自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，参考陈红梅等[17]文献中所述羟自由基清除率的测定方法，研究不同浓度枳椇子总黄酮清除羟自由基的性能，重复3次。

1.2.5.3 枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，参考杨喆等[18]文献中所述超氧阴离子自由基清除率的测定方法，研究不同浓度枳椇子总黄酮清除超氧阴离子自由基的性能，重复3次。

1.2.5.4 枳椇子总黄酮对DPPH自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，参考韦献雅等[19]文献中所述DPPH自由基清除率的测定方法，研究不同浓度枳椇子总黄酮清除DPPH自由基的性能，重复3次。

1.2.5.5 枳椇子总黄酮对ABTS自由基清除能力的测定

以茶多酚作为阳性对照，参考Campos等[20]文献中所述ABTS自由基清除率的测定方法，研究不同浓度枳椇子总黄酮清除ABTS自由基的性能，重复3次。

1.2.6 数据处理

使用Excel软件对数据进行统计分析并绘制图表，采用SPSS 23.0数据分析软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 枳椇子总黄酮提取工艺优化

2.1.1 枳椇子总黄酮提取单因素试验结果

2.1.1.1 料液比对枳椇子总黄酮提取率的影响

如图2所示，枳椇子总黄酮提取率随30%乙醇溶液添加量的增大整体呈现先缓慢上升后趋于平稳的现象。当料液比为1∶50（g/mL）时枳椇子总黄酮提取率虽达到最高值（2.86%±0.024%），但与料液比为1∶40（g/mL）时枳椇子总黄酮提取率无显著差异；同时，料液比为1∶40（g/mL）与料液比为1∶30（g/mL）、1∶60（g/mL）时枳椇子总黄酮提取率无显著差异，但极显著高于料液比为1∶10（g/mL）、1∶20（g/mL）时枳椇子总黄酮提取率（P＜0.01）。这是由于增加溶剂加大了浓度差，有利于植物细胞内溶质进入溶剂，从而使枳椇子总黄酮提取率增加[21]；而随着溶剂量的继续增加，总黄酮基本都已溶出，提取率不再有显著变化[22]。因此，综合考虑料液比宜选择1∶40（g/mL）。

2.1.1.2 乙醇体积分数对枳椇子总黄酮提取率的影响

如图3所示，随着乙醇体积分数的增大，枳椇子总黄酮提取率呈现先显著升高后显著下降的现象。当乙醇体积分数为40%时，枳椇子总黄酮提取率达到最高值（3.10%±0.044%），与乙醇体积分数为50%时枳椇子总黄酮提取率（3.05%±0.030%）无显著差异，但极显著高于其他各组（P＜0.01）。一方面，乙醇体积分数不同其极性亦不同，枳椇子总黄酮的极性可能与体积分数为10%的乙醇溶液最为接近，根据相似相溶原理，黄酮类化合物在此时能最大限度地从固体载体中转移到溶液中，故溶解度最高[23]；另一方面，植物组织中含有多种醇溶性物质，如色素、精油等，而高浓度的乙醇溶液会增加这些成分的溶出量，使之同黄酮类化合物竞争乙醇-水分子体系，从而表现为总黄酮提取率在保持平衡一段时间后出现下降的现象[24]。因此，乙醇溶液体积分数宜选择40%。

图3 不同乙醇体积分数对枳椇子总黄酮提取率的影响Fig.3 Effects of different ethanol concentrations on extraction rates of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.

2.1.1.3 浸提温度对枳椇子总黄酮提取率的影响

如图4所示，随着浸提温度的上升，枳椇子总黄酮提取率呈现先缓慢上升后急剧下降的趋势。当浸提温度为40℃时，枳椇子总黄酮提取率达到最高值（3.62%±0.111%），极显著高于其他各组（P＜0.01）。黄酮类化合物的结构在高温作用下会被破坏，且高温也会使乙醇挥发，浓度下降，表现为总黄酮提取率下降[25]。因此，浸提温度选择40℃左右为宜。

图4 不同浸提温度对枳椇子总黄酮提取率的影响Fig.4 Effects of different extraction temperatures on extraction rates of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.

2.1.1.4 浸提时间对枳椇子总黄酮提取率的影响

如图5所示，随着浸提时间的延长，枳椇子总黄酮提取率呈先显著升高后下降的趋势。当浸提时间为10 min时，枳椇子总黄酮提取率达到最大值（3.29%±0.051%）。延长浸提时间，溶剂对溶质的溶胀和渗透作用有助于黄酮类物质向溶剂扩散，提取率上升；但过度延长浸提时间，可能存在黄酮类物质结构被破坏[26]或枳椇子中的其他物质影响了黄酮类物质的溶出[27]。因此，浸提时间以10 min为宜。

2.1.2 乙醇浸提法提取枳椇子总黄酮的正交试验结果

乙醇浸提法提取枳椇子总黄酮的正交试验结果如表2所示，根据正交试验结果分析，比较各列的极差结果R值可知，RA＞RB＞RC＞RE，即各因素对枳椇子总黄酮提取率的影响程度大小为：料液比（A）＞乙醇体积分数（B）＞浸提温度（C）＞浸提时间（E），即在试验所设定的因素水平中，料液比对枳椇子总黄酮提取率的影响最大，其次是乙醇体积分数和浸提温度，浸提时间的影响程度最小。正交试验结果的方差分析如表3所示，根据表中F值大小可知，FA＞FB＞FC＞FE，这与表2极差分析结果相一致；显著性分析表明，料液比在α=0.1水平上对枳椇子总黄酮提取率的影响显著，其他因素影响不显著。通过对表2中K值的比较可知，A3B2C2E3为最优组合，即料液比1∶50（g/mL），乙醇体积分数40%，浸提温度40℃，浸提时间15 min。

表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

表3 正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

为验证最优工艺的有效性，以最优组合提取枳椇子总黄酮，重复3次，所得枳椇子总黄酮提取率为4.52%±0.043%，相对标准偏差（RSD）为1.009 5%，表明该提取工艺条件稳定可行。

2.2 枳椇子总黄酮抗氧化性能的试验结果

2.2.1 枳椇子总黄酮清除羟自由基能力如图6所示，枳椇子总黄酮对羟自由基的清除能力随质量浓度的增大而加强，且不同浓度枳椇子总黄酮对羟自由基清除率的影响差异极显著（P＜0.01），这与陈红梅等[17]和李玲等[28]对黄酮类物质抗氧化性能的研究结果相一致，表明枳椇子总黄酮对羟自由基的清除效果呈现显著的量效关系。质量浓度为0.39 mg/mL的枳椇子总黄酮对羟自由基清除率极显著高于0.2 mg/mL茶多酚对羟自由基的清除率（P＜0.01），但极显著低于0.25 mg/mL的茶多酚对羟自由基的清除率（P＜0.01），表明枳椇子总黄酮对羟自由基有较强的清除能力。

图6 不同浓度枳椇子总黄酮对羟自由基清除能力的影响Fig.6 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on hydroxyl radical scavenging capacities

2.2.2 枳椇子总黄酮清除超氧阴离子自由基能力

如图7所示，枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率随质量浓度的增大而显著加强，且不同浓度枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基清除率的影响差异极显著（P＜0.01），这与前人关于植物黄酮类物质对超氧阴离子的清除能力研究结果相一致[29-31]，表明枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果呈现显著的量效关系。当枳椇子总黄酮质量浓度为0.706 mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率极显著高于0.5 mg/mL的茶多酚（P＜0.01），表明枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基有较强的清除能力。

图7 不同浓度枳椇子总黄酮对超氧阴离子自由基清除能力的影响Fig.7 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on superoxide radical scavenging capacities

2.2.3 枳椇子总黄酮清除DPPH自由基能力

如图8所示，枳椇子总黄酮对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增大而加强，当浓度＜0.045 mg/mL时，不同浓度枳椇子总黄酮对DPPH自由基清除率的影响差异极显著（P＜0.01），表明枳椇子总黄酮对DPPH自由基的清除效果呈现显著的量效关系。因为黄酮类化合物分子和茶多酚中均含有具备供氢能力的酚性羟基，当孤对电子与还原态氢进行配对时，ABTS·即被还原形成DPPH-H，表现出显著的抗氧化能力[32]，当枳椇子总黄酮质量浓度为0.045 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率与1.5 mg/mL的茶多酚无显著差异，表明了枳椇子总黄酮对DPPH自由基有较强的清除能力。

图8 不同浓度枳椇子总黄酮对DPPH自由基清除能力的影响Fig.8 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on DPPH radical scavenging capacities

2.2.4 枳椇子总黄酮清除ABTS自由基能力

如图9所示，随着质量浓度的升高，枳椇子总黄酮对ABTS自由基清除率呈现显著增强的趋势，且不同浓度枳椇子总黄酮对ABTS自由基清除率的影响差异极显著（P＜0.01），表明枳椇子总黄酮对ABTS自由基的清除效果呈现显著的量效关系。不同于供氢清除DPPH自由基，ABTS自由基被抗氧化剂清除的过程是电子转移过程，而黄酮类化合物和茶多酚均具备较强电子供应能力[33]，当枳椇子总黄酮质量浓度为0.082 mg/mL时，其对ABTS自由基的清除率与0.15 mg/mL的茶多酚无显著差异，表明枳椇子总黄酮对ABTS自由基有较强的清除能力。

图9 不同浓度枳椇子总黄酮对ABTS自由基清除能力的影响Fig.9 Effects of different concentrations of total flavonoids from Hovenia acerba Lindl.on ABTS radical scavenging capacities

3 结论

本研究采用乙醇浸提法提取枳椇子总黄酮，其最佳提取工艺条件为：乙醇体积分数40%，料液比1∶50（g/mL），浸提温度40℃，浸提时间15 min，在此工艺条件下枳椇子总黄酮提取率为4.52%±0.043%，其对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除效果，呈现出较强的抗氧化能力，试验结果为制备具有抗氧化能力的枳椇子总黄酮及其应用提供了一定的理论基础。