血清分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型对浸润性肺腺癌的诊断价值

林帅东 续力云 陆畅畅 石邈 黄燕燕 乐涵波

分泌型丝氨酸蛋白酶型抑制剂Kazal 1（serine protease inhibitor kazal type 1,SPINK1）是一种大小为6.2 KDa的丝氨酸蛋白酶分泌抑制剂，最初分离于卵巢癌患者尿液，又名肿瘤相关组织抑制剂（tumor associated tissue inhibitor,TATI）[1]。此后，SPINK1 被发现过表达于多种肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等[2-3]。SPINK1的结构与表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）相似，可通过激活EGFR/MAPK信号通路刺激肿瘤细胞增殖从而影响肿瘤进展，还可促进上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）参与肿瘤转移[4-8]。

目前有多项研究对血清、肿瘤组织以及尿液进行了分析，发现了SPINK1作为生物标志物的潜在价值[3]。然而，SPINK1在肺腺癌患者血液中的表达情况如何尚不清楚。因此，笔者通过测定肺腺癌患者血清SPINK1浓度，分析其与癌组织SPINK1蛋白表达水平的相关性以及其与临床病理特征之间的关系，探讨其作为血清标志物对浸润性肺腺癌的潜在诊断价值，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2014年1月至2019年12月在浙江大学舟山医院接受肺叶切除手术或肺楔形切除手术的153例肺腺癌患者的术前血液样本及手术标本，患者男55例，女98例，平均年龄56.2岁；其中原位腺癌38例，微浸润性腺癌39例，浸润性肺腺癌76例。选择同期本院健康志愿者28例血液样本，志愿者男10例，女18例，平均年龄55.7岁。两组受试者性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有对象均知情同意。

1.2 方法 两组受试者均采集清晨空腹血2 ml。采血后立即离心，分离血清，保存于-80°C冰箱备用。

1.3 血清SPINK1浓度的检测 采用ELISA法。按ELISA试剂盒（Human SPINK1 Duoset,R＆D system,USA）说明书操作。将所有稀释的样品和标准品加入孔中，室温下孵育2 h，弃上清液，用洗涤缓冲液洗小孔3次，洗涤完毕后加入已稀释的SPINK1抗体，室温孵育2 h。再次用洗涤缓冲液洗3次，每孔加入100 μl稀释的辣根过氧化物酶，室温孵育20 min。用洗涤缓冲液洗3次后每孔中加入100 μl底物，室温避光孵育20 min，加反应终止液终止反应，上机检测450 nm处吸光度，根据标准曲线公式计算每个小孔中的SPINK1浓度。所有检测的血清样本以及标准样本和空白对照均重复检测3次。

1.4 肺腺癌患者癌组织及癌旁组织中SPINK1 mRNA的检测 采用荧光定量PCR法。将肺组织放入研磨器中，按照重量体积1∶9的比例加入1×PBS缓冲液，充分研磨后按4℃、3 000r/min、15 min离心，弃上清液，加入1 ml Trizol液并充分混匀后提取RNA。以提取的RNA为模板进行反转录，产物即cDNA，放于-20℃备用。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Applied Biosystems）进行 qRT-PCR，并在 ABI 7500（Thermo，Waltham，MA） 按以下条件下运行：95 ℃10 min，然后在95℃ 15 s变性，60℃ 1 min退火，72℃ 15延伸的40个循环中运行。末次循环后行熔解曲线检测反应产物单一性。SPINK1引物序列如下，上游引物：5'-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC-3'，下游引物：5'-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA-3'，扩增的基因片段长度为114 bp。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算SPINK1 mRNA的表达水平。

1.5 肺腺癌患者癌组织及癌旁组织SPINK1蛋白表达检测 采用免疫组织化学染色法。每个手术切除的组织样本经多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋，连续切取4个4 μm厚切片。经如下步骤：脱蜡、封闭、抗原修复，滴加小鼠抗人SPINK1单克隆抗体（Abcam）、冲洗、滴加生物素二抗、冲洗、显色。在染色过程中，以磷酸盐缓冲液代替原代抗体的切片作为阴性对照。由2位病理科副主任医师评价免疫反应染色强度（stainingintensity,si）和阳性细胞百分比（positivepercent,pp），并对染色结果进行评分。si评分：0分为未见阳性细胞，1分为细胞阳性染色最强处呈现弱阳性，2分为阳性，3分为可见强阳性染色的细胞。pp评分：0分为无染色阳性区域，1分为阳性染色区域≤10%，2分为阳性染色区域11%～50%，3分为阳性染色区域51%～80%，4分为阳性染色区域＞80%。免疫组化染色得分=si分值×pp分值。最后按照得分分为高表达组（7～12分）与低表达组（0～6分）。

1.6 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验。计数资料组间比较采用χ2检验。血清SPINK1浓度与癌组织SPINK1 mRNA表达水平的关系分析采用Pearson相关；浸润性肺腺癌的预测因素分析采用单因素及多因素logistic回归；通过绘制血清SPINK1以及癌胚抗原（CEA）的ROC曲线，评价血清SPINK1对浸润性肺腺癌的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌患者与健康志愿者血清SPINK1浓度的比较 浸润性肺腺癌患者血清SPINK1浓度为（1 868±105.5）pg/ml明显高于健康志愿者的（842.0±70.36）pg/ml、原位腺癌的（966.2±75.18）pg/ml、微浸润性腺癌的（1 076±60.40）pg/ml，差异均有统计学意义（均 P＜0.01）；而原位腺癌、微浸润性腺癌患者与健康志愿者间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 血清SPINK1浓度与肺腺癌组织SPINK1 mRNA水平的相关性分析 血清SPINK1浓度与癌组织SPINK1 mRNA表达水平呈正相关（r=0.277，P=0.014），见图1。以肺腺癌患者血清SPINK1浓度的平均值1 419 pg/ml为临界值，分为血清SPINK1高浓度组71例和低浓度组82例，对比两组患者癌组织SPINK1蛋白表达水平，结果发现，血清SPINK1低浓度组在SPINK1蛋白低表达组中上占29%，高浓度组在SPINK1蛋白低表达组中上占17%，血清SPINK1低浓度组在SPINK1蛋白高表达组中上占13%，高浓度组在SPINK1蛋白高表达组中上占41%，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。典型患者肺腺癌组织和相应癌旁组织SPINK1蛋白表达见图3。

图1 血清分泌型丝氨酸蛋白酶型抑制剂Kazal 1（SPINK1）浓度与癌组织SPINK1 mRNA表达水平的散点图

图2 血清分泌型丝氨酸蛋白酶型抑制剂Kazal 1（SPINK1）高浓度组与低浓度组患者癌组织SPINK1蛋白表达水平比较

图3 典型患者免疫组织化学染色病理检查图（a：肺腺癌组织；b：相应癌旁组织；×200）

2.3 肺腺癌患者血清SPINK1浓度与临床病理特征的关系 高浓度组与低浓度组患者在性别、年龄、吸烟史、淋巴结转移和胸膜侵犯间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），而在病理类型、肿瘤大小以及 TNM分期间比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2。

表2 肺腺癌患者血清SPINK1浓度与临床病理特征的关系[例（%）]

2.4 浸润性肺腺癌预测因素分析 单因素分析发现，血清SPINK1浓度、CEA和肿瘤大小与浸润性肺腺癌发生的风险有关。进一步多因素分析显示，血清SPINK1浓度、CEA和肿瘤大小是浸润性肺腺癌的独立预测因素。见表3。

表3 浸润性肺腺癌预测因素分析

2.5 血清SPINK1浓度、CEA对浸润性肺腺癌的诊断价值 血清SPINK1浓度诊断的AUC为0.83，最佳截断值为1 288.5729 pg/ml，灵敏度为0.743，特异度为0.827。而CEA诊断的AUC为0.73，最佳截断值为1.975pg/ml，灵敏度为0.586，特异度为0.800。见图4。

图4 血清分泌型丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1（SPINK1）浓度和癌胚抗原（CEA）诊断浸润性肺腺癌的ROC曲线（a：血清SPINK1浓度；b：CEA）

3 讨论

研究发现SPINK1的氨基酸序列与表皮生长因子（EGF）相似[9]。因此，SPINK1被认为可能是一种自分泌或旁分泌生长因子。有研究证实，SPINK1在多种恶性肿瘤血液中可被检测到，但在肺腺癌血液中的研究还鲜有报道[10-11]。本研究前期发现，SPINK1在肺癌组织高表达并与预后相关，在此基础上进一步探讨了肺腺癌血清SPINK1浓度及其在组织中表达水平的关系以及与临床病理特征的关系，以及其作为浸润性肺腺癌诊断的潜在标志物的可行性。

已有研究发现，大多数胰腺癌患者SPINK1血清浓度明显升高[10]。另一项研究也发现，肝癌患者血浆SPINK1浓度亦显著升高[11]。在50%的结直肠癌患者中亦观察到血清SPINK1浓度升高并且与预后相关[12]。本研究发现，与健康志愿者相比，肺腺癌患者血清SPINK1表达上调，与目前的研究结果相一致。前期研究发现，与癌旁组织相比，肺腺癌组织SPINK1表达上调。在此基础上，笔者进一步分析了血清SPINK1浓度与癌组织SPINK1表达水平的相关性，结果发现血清SPINK1浓度与癌组织SPINK1 mRNA表达水平呈正相关，与癌组织SPINK1蛋白表达水平亦呈正相关，提示血清SPINK1浓度随着癌组织SPINK1表达水平变化而变化，提示血清浓度可反映癌组织SPINK1表达水平，具有作为血清诊断标志物的潜力。

本研究进一步分析了肺腺癌患者血清SPINK1浓度与临床病理特征的关系，结果发现，高浓度组与低浓度组患者在不同病理类型、肿瘤大小以及TNM分期比较差异均有统计学意义。本研究发现，与原位腺癌与微浸性肺腺癌组相比，浸润性肺腺癌相血清SPINK1高浓度者占比较高。2011年公布的肺腺癌新分类标准中指出，原位腺癌与微浸性肺腺癌，这两类患者若接受根治性手术，则其疾病特异性生存率分别为100%或接近100%，而浸润性肺腺癌生存率相对较低。因此，原位腺癌与微浸润腺癌被认为是早期腺癌阶段，而浸润性肺腺癌恶性程度较高。笔者发现，与肿瘤大小≤1 cm组相比，＞1 cm组肺腺癌血清SPINK1高浓度者占比较高；与TisN0M0～Ⅰ组相比，Ⅱ～Ⅳ分期组血清SPINK1高表达者占比亦较高。以上结果提示，血清SPINK1可能是恶性程度较高肺腺癌诊断的标志物。笔者进一步探讨了SPINK1对浸润性肺腺癌的诊断效能，结果显示，AUC可达0.83，灵敏度为0.743，特异度为0.827，表明血清SPINK1对浸润性肺腺癌具有良好的诊断效能。因此，本研究认为血清SPINK1可作为浸润性肺腺癌的血清生物标志物。然而，血清SPINK1的确切来源，具体是由哪些类型的细胞分泌而来的尚无直接证据。现有研究报道以及本研究结果提示，血清SPINK1可能是部分肿瘤细胞分泌而来。然而，发表于Nature Communication的一项研究证实，肿瘤微环境基质细胞能够分泌SPINK1[13]。因此，笔者推测部分血清SPINK1是由肿瘤基质细胞分泌的。分泌的SPINK1在肺腺癌发生、发展中的作用，目前尚不清楚，有待进一步研究。

本研究尚有不足之处。首先，纳入的肺腺癌患者尚无5年生存数据，因此，不能分析血清SPINK1与患者预后关系。其次，样本例数相对较少，需要进一步扩大样本量。本研究探索的SPINK1作为浸润性肺腺癌患者血清诊断标志物的可行性，将为肺腺癌的诊断提供新的靶点。