高分辨率MRI联合微小RNA-135a-5p、微小 RNA-373对宫颈癌的诊断价值研究

叶梦茜 干金妮 张敏鸽

宫颈癌是原发于子宫颈部位的恶性肿瘤，其病因多为HPV感染、多孕多产、初产年龄小及沙眼衣原体、单纯疱疹病毒Ⅱ型感染等[1]。患者在早期时无明显症状、体征，但在疾病发生、发展过程中可伴随阴道流血、阴道排液、下肢肿痛、输尿管梗阻及贫血、恶病质等全身衰竭症状，对患者的生命健康造成严重威胁[2]。寻找疾病早期诊断的有效方法对指导临床治疗、改善患者预后尤为重要。目前，临床上用于诊断宫颈癌的影像学技术有子宫超声、CT、MRI等检查，其中MRI检查具有良好的软组织分辨力，可有效分辨肿瘤与正常组织，直观显示盆腔内各器官的解剖结构、各组织间的层次及肿瘤与正常组织的差异，为判断肿瘤侵犯范围提供了直观的解剖基础[3-4]。近年来，miRNA与肿瘤的关系成为研究的热点，不同miRNA具有差异性，可发挥抑癌或促癌作用，其中miRNA与宫颈癌的关系十分密切，如miR-9在宫颈癌中是促癌基因，但微小RNA-135a-5p（microRNA-135a-5p,miR-135a-5p）、微小RNA-373（microRNA-373,miR-373）在宫颈癌的发生、发展中起何种作用尚不明确[5]。因此，本研究探讨高分辨率MRI联合miR-135a-5p、miR-373对宫颈癌的诊断价值，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2018年9月至2020年9月浙江省台州医院行宫颈病理检查患者132例。根据病理检查结果分为宫颈癌（恶性组）89例和宫颈癌前病变（良性组）43 例。恶性组年龄 42～65（50.83±10.92）岁；病理类型：鳞癌75例，腺癌14例；分化程度：低分化41例，中分化28例，高分化20例；TNM分期：Ⅰ期52例，Ⅱ期37例。良性组年龄 41～64（49.88±10.87）岁；癌前病变（CIN）分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期10例，Ⅲ期9例。纳入标准：宫颈癌组符合《宫颈癌诊断与治疗指南（第四版）》[6]中宫颈癌的诊断标准；所有患者均未接受生物学、放射、化学等治疗且未合并恶性肿瘤及免疫系统相关疾病；临床病历资料与影像学资料完备、真实。排除标准：处于妊娠期、哺乳期者；近1个月内接受宫颈治疗者；合并如肠道、乳腺肿瘤等其他脏器肿瘤者；精神障碍者；重要脏器功能不全者；临床与影像学资料缺乏者。两组患者年龄的差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 高分辨率MRI检查方法 所有患者入院第1天行高分辨率MRI检查。采用GE 3.0 T超导MRI系统[宜禾（北京）投资管理有限公司，型号：SIGNA Ploneer]，体部射频发射线圈。患者于检查前1 h饮水约500 ml以适度充盈膀胱，取仰卧位，对髂棘至坐骨结节进行扫描。高分辨率MRI成像序列：快速自旋回波T1WI，重复时间（TR）480 ms，回波时间 12 ms，采集矩阵 512×512，视野（FOV）160 mm×160 mm，层厚3 mm，层间距0 mm；快速自旋回波T2WI，TR 4 500 ms，回波时间130 ms，采集矩阵 512×512，FOV 160 mm×160 mm，层厚3 mm，层间距0 mm，分别行轴位、矢状位和冠状位扫描。屏气轴位可变容积加速肝脏采集（liver acquisition with volume acceleration-flexible,LAVAFlex）动态增强扫描：瞬时弹性成像（TE）1.9 ms，TR 4.1 ms，矩阵 288×208，FOV 274 mm×379 mm，层厚3.0 mm，扫描层数30层；采用高压注射器静脉注射扎喷酸葡胺（上海旭东海普药业有限公司，国药准字：H19991127，规格 15 ml/支）0.2 ml/kg，流速 2 ml/s，随后以流速2 ml/s注射0.9%氯化钠注射液20 ml，注药后15～70 s开始扫描，可得到动脉早期到静脉晚期多期的图像资料。

1.2.2 miR-135a-5p、miR-373表达水平的检测 分别抽取两组患者清晨空腹静脉血3 ml，3 000 r/min离心10 min，分离上层血清，-80℃保存、待用。采用RT-PCR法检测miR-135a-5p、miR-373表达水平，实验步骤：将1 ml TRNzol加入血清样本取总DNA并检测其纯度和浓度，提取2 μg总DNA并加入内参GAPDH及目的小分子RNA miR-135a-5p、miR-373逆转录引物，逆转录反应条件：42℃ 15 min，85℃ 5 s，逆转录合成cDNA；PCR反应条件：95℃ 预变性10 min，反应条件：95℃、60 ℃、95 ℃、60 ℃、95 ℃时间分别 12 s、40 s、15 s、30 s、15 s，40个循环，使用Primer5.0软件对引物序列进行设计，miR-135a-5p引物序列上游：5'-TATGGCTTTTTATTCCTATGTGA-3'，下游：5'-TTGGTCTTGTTTCCCGGTCC-3'；miR-373 引物序列上游：5'-CGCTAGCCAGTCGACATCAC-3'，下游：5'-GCATCCAGACCTACATGCA-3'；内参GAPDH引物序列上游：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3'，下游：5'-GACTGTGGTCAT-GAGTCCTTCCA-3'。

1.3 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，等级资料的比较采用秩和检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用ROC曲线分析高分辨率MRI联合miR-135a-5p、miR-373对宫颈癌的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高分辨率MRI图像分析 常规T1WI序列显示阴道后穹窿消失，穹窿边缘毛糙，高分辨率MRI序列显示阴道后穹窿与病灶间隙可见，4例典型病例的MRI图像见图1；常规T2WI序列显示阴道壁低信号消失、周围脂肪间隙模糊，高分辨率MRI序列显示阴道壁低信号存在，4例典型病例的MRI图像见图2。

图1 4例典型宫颈癌患者的常规T1WI序列图像（a：44岁患者；b：50岁患者；c：57岁患者；d：63岁患者）

图2 4例典型宫颈癌患者的常规T2WI序列图像（a：44岁患者；b：50岁患者；c：57岁患者；d：63岁患者）

2.2 两组患者miR-135a-5p、miR-373表达水平的比较 恶性组miR-135a-5p、miR-373表达水平均高于良性组，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 两组患者miR-135a-5p、miR-373表达水平的比较

2.3 miR-135a-5p、miR-373表达水平与宫颈癌患者临床特征的关系 miR-135a-5p、miR-373表达水平在不同年龄、绝经与否宫颈癌患者中的差异均无统计学意义（均P＞0.05）；而阳性高危型HPV、鳞癌、低分化、有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴血管间隙浸润及深浸润宫颈癌患者miR-135a-5p、miR-373表达水平均高于阴性高危型HPV、腺癌、高与中分化、无淋巴结转移、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴血管间隙浸润及无浸润与浅浸润宫颈癌患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表 2。

表2 miR-135a-5p、miR-373表达水平与宫颈癌患者临床特征的关系分析

2.4 高分辨率MRI联合miR-135a-5p、miR-373诊断宫颈癌的效能 ROC曲线分析显示高分辨率MRI联合miR-135a-5p、miR-373对宫颈癌的诊断价值高于3个单项检测，单项检测的灵敏度、特异度、准确度均低于3项联合检测，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3和图3。

图 3 高分辨率 MRI、微小 RNA-135a-5p（miR-135a-5p）、微小RNA-373（miR-373）及3项联合检测诊断宫颈癌的ROC曲线

表3 高分辨率MRI、miR-135a-5p、miR-373及3项联合检测对宫颈癌的诊断效能比较

3 讨论

宫颈癌是女性生殖道恶性肿瘤之一，是女性中发病率仅次于乳腺癌的第2个常见恶性肿瘤，据数据显示，其发病率呈升高和低龄化趋势，严重威胁女性的生理及心理健康[7]。目前，临床上对宫颈癌的诊断主要依靠碘试验、阴道镜、活组织检查及宫颈刮片细胞学检查等手段，但有疼痛、组织损伤等缺点，患者接受程度较低且无法有效判断浸润深度[8-9]。随着影像学技术的快速发展，高分辨率MRI逐渐应用于临床，因其具有高时间分辨率及软组织分辨率，可清楚显示子宫肌壁结构、宫颈基质环、肌层及浆膜层，有助于术前分期、判断肿瘤肌层浸润情况和盆腔侵犯范围，为宫颈癌的诊断提供了新方法[10]。韦洁勤等[11]研究发现，高分辨率MRI具有高信噪比、高图像分辨率、良好的脂肪抑制、更高的时间分辨率等特点，可准确反映病变的血流动力学等，可显著改善肿瘤形态学、血流动力学、功能学等方面的影像学显示，其原因可能为动态增强扫描可更好地显示宫颈癌灶与周围组织的关系、反应癌灶血供情况，为了解肿瘤的生物学行为提供间接依据。王志刚等[12]研究发现，高分辨率MRI在宫颈癌的影像学特征显示中具有显著优势，其中T2WI对显示盆腔内重要的解剖结构更加清晰，其原因可能为在动态增强时坏死灶周边残留的癌变组织呈增强环，有助于确定癌灶边界，更好地显示间质及宫旁浸润程度，进而提高肿瘤发现率。本研究发现，高分辨率MRI利用盆腔脂肪信号的天然对比，更清晰显示宫颈黏膜层、肌层、周围间质及正常脂肪高信号与病灶本身。

miRNA对肿瘤的发生、发展具有重要的基因调控功能，对肿瘤的诊断和预后判别具有一定的参考作用，已受到医学界的关注，其中宫颈癌也具有独特的miRNAs表达谱，探讨其在宫颈癌发生机制中的作用，对筛选高危人群和早期防治有积极意义[13-14]。临床实践表明，miR-135a-5p是miR-135家族中主要成员之一，其在宫颈癌患者体内呈高表达，提示其在宫颈癌发生、发展中作为促癌基因，参与恶性肿瘤细胞周期、增殖与凋亡，且与肿瘤大小、FIGO分期、淋巴结转移有关[15]。有研究显示，随着宫颈病变miR-135a-5p表达水平上调，且与宫颈癌临床分期与淋巴结转移情况相关，初步证实miR-135a-5p可能在宫颈癌恶性转化和淋巴结转移中具有重要调节作用，提示其可能作为致癌基因参与宫颈癌的发生、发展[16-17]。本研究中，miR-135a-5p在宫颈癌患者血清中表达水平显著高于宫颈癌前病变患者，说明miR-135a-5p可能参与宫颈癌的形成，其机制可能为通过调控肿瘤细胞侵袭抑制因子表达，影响宫颈癌细胞的糖酵解和上皮-间充质转化。

丛竹军等[18]的研究发现，miR-373在癌旁组织中表达水平显著低于乳腺癌组织，其可介导Bcl-6抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力，初步揭示miR-373在恶性肿瘤的增殖侵袭过程中发挥重要作用。miR-373在宫颈癌组织中高表达，其表达水平明显高于良性组织，在功能上起到了促癌基因的作用。Lv等[19]提出miR-373作为一个新的癌基因，其在睾丸精原细胞瘤中通过阻断p53通路来参与肿瘤的进展，也可以通过作用于靶基因PPP6C调节细胞周期来促进肝癌细胞的生长。miR-373可通过作用于Wnt/β-acting信号转录而促进肿瘤的发生，其在肺癌疾病中基因表达下调，原因可能为miR-373主要功能为促进肿瘤的发生[20]。有研究显示，miR-373在宫颈癌组织中呈高表达[21]，与本研究结果一致。但2012年Yuan等[22]研究中miR-373在宫颈癌组织中呈低表达，在功能上起到抑癌基因的作用，与本研究结果相悖，其原因可能为纳入样本量与数据统计方面有差异。本研究中，miR-373在宫颈癌组织中呈高表达，且与宫颈癌患者高危型HPV、病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、淋巴血管间隙浸润、浸润程度有关。

综上所述，高分辨率MRI对早期诊断宫颈癌具有一定价值，miR-135a-5p、miR-373与宫颈癌患者高危型HPV、病理类型、分化程度、淋巴结转移、TNM分期、淋巴血管间隙浸润、浸润程度有关且均参与宫颈癌的发生、发展过程，为宫颈癌的早期诊治提供一定的理论参考，但是本研究纳入病例数较少，仍需要今后进一步研究。