布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞增殖、侵袭和微管形成的影响

杨寿娟，黄国鹏，任青竹，蒋云川

原发性胆囊癌发病率在胆囊恶性肿瘤中占第1位，女性发病率比男性高2～4倍，常见发病年龄为50～70岁[1-2]。胆囊癌的侵袭性很强，在早期无明显的症状、体征，典型的晚期临床症状表现为腹痛、腹部肿块、黄疸、呕吐、腹水[3]。手术切除是胆囊癌最主要治疗手段，但复发率高，手术疗效有限，预后不佳[4]。大量证据表明，手术中应用的麻醉药物类型可能影响患者的长期预后结果[5]。有研究表明，手术过程中采用局部麻醉联合全身麻醉能减少癌症的复发风险，并改善总生存率[6]。还有研究表明，局部麻醉可以减少各种癌症手术患者的肿瘤转移和复发[7]。布比卡因是与酰胺相关的局部麻醉剂，常用于缓解癌症患者在手术中和术后的疼痛。相关研究表明，布比卡因能抑制结直肠腺癌细胞的增殖和迁移，并增强内质网应激[8]。在卵巢癌中布比卡因能通过激活内源性和外源性凋亡通路起到直接的抗癌作用，但在前列腺癌中仅能激活内源性凋亡通路[9]。已有临床研究表明，布比卡因具有直接的抗癌活性，能够抑制胃癌的侵袭能力[10]。基于以上结论，本研究旨在评估布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞增殖、侵袭、间质转换和微管形成的影响,报告如下。

1 材料与方法

1.1细胞培养及处理 胆囊癌GBC-SD细胞购自中国科学院细胞库。用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃条件下进行培养。各实验组将盐酸布比卡因等渗溶液(Marcaine，0.5% W/V，AstraZeneca，Luton，UK)用培养基稀释至相应浓度，同时对照组将相同比例的磷酸盐缓冲液加入培养基,对胆囊癌GBC-SD细胞进行处理。

1.2CCK-8法检测细胞活性 在96孔板中，将胆囊癌GBC-SD细胞分别用不同浓度布比卡因(0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L)处理24 h时，然后向每孔加入10 μl的CCK-8溶液。最后用酶联免疫分析仪在450 nm处测量吸光度。以各浓度处理组细胞吸光度与0.15 mmol/L组细胞吸光度的比值表示细胞活性。

1.3克隆形成实验 将不同浓度布比卡因处理及对照组胆囊癌GBC-SD细胞接种在6孔板中，培养14 d后，弃去培养基，将细胞用乙醇固定30 min，并用0.5%结晶紫染色。最后，将细胞用去离子水冲洗以干燥，并拍摄照片。

1.4Western blot检测 将不同浓度布比卡因处理及对照组胆囊癌GBC-SD细胞，用裂解缓冲液裂解，在4 ℃条件下，14 000 r/min离心15 min。浓缩蛋白质浓度用BCA试剂盒进行测量(上海碧云天生物有限公司)。取20 μg总蛋白在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至PVDF膜。将PVDF膜在37 ℃下用5%牛血清白蛋白封闭1 h，然后加入抗p21、Survivin、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和血管内皮生长因子(VEGF)，在4 ℃条件下过夜。用TTBS缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反应1 h；洗膜后ECL曝光成像并应用quantity one软件分析蛋白条带的灰度值。

1.5Transwall实验 将不同浓度布比卡因处理及对照组胆囊癌GBC-SD细胞以5×104/200 μl接种在Transwell小室上部，使用不含血清的DMEM培养基培养。下腔室充满含10%胎牛血清的EMEM培养基。孵育24 h后，将下腔室中的细胞在95%乙醇中固定，用苏木精染色。使用倒置显微镜拍照(×100)，采用Image-Pro Plus分析软件计数迁移过膜的细胞。

1.6微管形成实验 将Matrigel人工基质胶稀释后平铺于24孔板底部，将不同浓度布比卡因处理的胆囊癌GBC-SD细胞以5×104/200 μl接种于24孔板，常规培养16 h，每隔4 h观察微管样结构形成情况。使用倒置显微镜随机拍照(×100)，采用MicrovisionSaisam软件分析微管形成结节数。

2 结果

2.1布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞活性的影响 CCK-8法检测结果显示，随着布比卡因浓度的增加，胆囊癌GBC-SD细胞活性显著下降(P<0.05)。与1.25 mmol/L比较，2.5和5 mmol/L布比卡因处理后细胞活性显著下调(P<0.05)，与2.5 mmol/L比较，5 mmol/L布比卡因处理后细胞活性显著下调(P<0.05)。见图1。本研究选择布比卡因浓度为1.25、2.5、5 mmol/L进行后续实验。

2.2布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞增殖的影响 克隆形成实验结果显示，1.25 mmol/L组细胞克隆形成比率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组细胞克隆形成比率显著下调(P<0.01)。与2.5mmol/L组比较，5 mmol/L组细胞克隆形成比率显著下调(P<0.05)。见图2。

2.3布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞p21、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，1.25 mmol/L组p21、Survivin蛋白表达量和Bax/Bcl-2比率与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组p21蛋白表达量和Bax/Bcl-2比率显著上调，而Survivin蛋白表达量显著下调(P<0.01)。与2.5 mmol/L组比较，5 mmol/L组p21蛋白表达量和Bax/Bcl-2比率显著上调，而Survivin蛋白表达量显著下调(P<0.05)。见图3。

2.4布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞侵袭力的影响 Transwell实验结果显示，1.25 mmol/L组细胞侵袭力与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组细胞侵袭力显著降低(P<0.01)。与2.5 mmol/L组比较，5 mmol/L组细胞侵袭力显著降低(P<0.05)。见图4。

2.5布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，1.25 mmol/L组E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组N-cadherin和Vimentin蛋白表达量显著下调，而E-cadherin蛋白表达量显著上调(P<0.05)。与2.5 mmol/L组比较，5 mmol/L组N-cadherin和Vimentin蛋白表达量显著下调，而E-cadherin蛋白表达量显著上调(P<0.05)。见图5。

2.6布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞微管形成及VEGF蛋白表达的影响 微管形成实验结果显示，1.25 mmol/L组微管形成结节数与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组微管形成结节数降低(P<0.05)。与2.5 mmol/L组比较，5 mmol/L组微管形成结节数降低(P<0.05)。Western blot检测结果显示，1.25 mmol/L组VEGF蛋白表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组和1.25 mmol/L组比较，2.5 mmol/L组和5 mmol/L组VEGF蛋白表达量下调(P<0.05)。与2.5 mmol/L组比较，5 mmol/L组VEGF蛋白表达量下调(P<0.05)。见图6。

3 讨论

胆囊癌是胆道最常见的恶性肿瘤，也是第6常见的胃肠道癌症[11]。布比卡因是一种常用的局部麻醉剂。本研究旨在评估布比卡因对胆囊癌GBC-SD细胞增殖、侵袭和微管形成的影响。

克隆形成实验结果表明，布比卡因处理后，胆囊癌GBC-SD细胞克隆形成比率显著降低。p21作为细胞周期抑制因子和抗增殖效应因子在体内发挥重要作用[12]。Survivin是细胞周期G2/M期表达的凋亡抑制蛋白，参与细胞分裂，影响细胞存活和增殖，可在大多数人类肿瘤组织中表达，但在正常分化的组织中不表达[13]。Bax/Bcl-2-p53表达增加能够对人脑胶质瘤细胞的增殖起到抑制作用[14]。有研究表明，布比卡因能抑制胃癌细胞活性、转移和糖酵解过程，促进胃癌细胞凋亡[15]。本实验中，布比卡因处理后，胆囊癌GBC-SD细胞p21蛋白表达量和Bax/Bcl-2比率显著上调，而Survivin蛋白表达量显著下调。上述结果表明布比卡因能够抑制胆囊癌GBC-SD细胞增殖。

Transwell实验结果表明，布比卡因处理后，胆囊癌GBC-SD细胞侵袭力显著降低。E-cadherin是肿瘤抑制蛋白，其在肿瘤细胞中的表达与上皮-间质转化有关，E-cadherin表达的缺失能够促进肿瘤进展和转移[16]。N-cadherin的异常表达与人类恶性肿瘤的转化、黏附、凋亡、血管生成、侵袭和转移等方面密切相关[17]。Vimentin是正常生理条件下间充质细胞可塑性以及发生上皮-间质转化癌细胞迁移所必需的因子[18]。布比卡因能有效抑制卵巢癌和前列腺癌肿瘤细胞的增殖能力和迁移率[19]。本实验结果显示，布比卡因处理后，胆囊癌GBC-SD细胞N-cadherin和Vimentin蛋白表达量显著下调，而E-cadherin蛋白表达量显著上调。上述结果表明布比卡因能够抑制胆囊癌GBC-SD细胞侵袭能力。

微管形成实验结果表明，布比卡因处理后，胆囊癌GBC-SD细胞微管形成结节数显著降低，VEGF蛋白表达量显著下调。VEGF是一种关键的血管生成因子，能够为肿瘤定向毛细血管网的持续生长创造有利条件，促进了肿瘤的生长、进展和转移[20]。多种阻断VEGF药物的研发目的是抑制肿瘤生长和转移[21]。上述研究表明，布比卡因具有抑制胆囊癌GBC-SD细胞微管形成和VEGF蛋白表达的作用。

综上所述，布比卡因具有抑制胆囊癌GBC-SD细胞增殖、侵袭和微管形成的作用。本研究仅为体外细胞实验和机制的初步探讨，体内试验有待进一步研究。