浒苔多酚协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞菌落总数和油脂氧化的作用

胡科娜，谷贵章，高兴杰，张进杰,，杨文鸽，徐大伦

（1.宁波大学食品与药学学院，浙江 宁波 315000；2.湖州市食品药品检验研究院，浙江 湖州 313000）

鳗鱼鲞是鳗鱼的半干腌制品，将新鲜海鳗延脊背对称切开，取出内脏和鳃板，洗净后盐腌，再悬挂于阴凉通风处干制而成。鳗鱼鲞富含油脂、蛋白质和水分，但在贮藏过程中容易发生氧化酸败，特别是在微生物、热、光等的作用下，表面和内部的脂质分子发生氧化，释放的游离脂肪酸分解为醛、酮、酸、醇等物质，产生强烈的刺激性气味[1]，对鳗鱼鲞的营养和风味造成严重影响。

电子束辐照杀菌是目前较佳的食品冷杀菌和保鲜技术[2]。一定剂量电子束能有效杀灭蝇虫和微生物。然而，对于高蛋白、油脂和水分含量的食品，由于水在辐照杀菌过程中会产生羟自由基，羟自由基能促进蛋白质和油脂发生氧化，导致食品产生异味，即辐照异味[3]。大量研究也表明，高剂量的电子束辐照会加重食品中的辐照异味，在猪肉、咸鸭肉和鸡肉的辐照杀菌中均发现了脂肪氧化和辐照气味残留问题[4-6]。电子束辐照会促进油脂和蛋白与食品表面和内部间隙的少量氧气分子发生氧化反应[7]，从而使油脂的氧化酸败程度加剧。目前，抑制氧化和消除辐照异味最常用的方法是添加抗氧化剂。植物多酚作为一种天然抑菌剂，可以抑制微生物生长过程中所需酶的活性，具有增加细胞膜通透性和抑制蛋白表达的作用[8]。研究发现，植物多酚在保护鱼片脂质和蛋白氧化的同时，能够抑制微生物的生长并延长鱼片的保鲜时长[9]。浒苔多酚（Enteromorpha proliferapolyphenols，EPP）来源于海洋绿藻植物——浒苔，是采用乙醇提取法得到的多酚混合物。因其源自海洋，EPP与海洋鱼类食品的风味具有兼容性。

本研究以鳗鱼鲞为实验对象，将EPP和电子束辐照处理加入鳗鱼制作工艺，通过对鳗鱼鲞在6 个月贮藏过程中菌落总数和油脂氧化指标（酸价、碘价、过氧化值、p-茴香胺值（p-anisidine value，p-AV）以及脂肪氧合酶活力）进行检测，研究EPP预处理对减缓贮藏期间低剂量电子束辐照处理鳗鱼鲞中油脂氧化酸败的效果，以期为高品质鳗鱼鲞的加工提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜东海海鳗（体长60～80 cm）、浒苔（干制，产于宁波象山港，收获期为2019年3月）购于宁波市路林水产品市场。

石油醚、乙醚、异丙醇、碘化钾、硫代硫酸等（均为分析纯） 阿拉丁生化科技股份（上海）有限公司；冰醋酸、异辛烷、三氯甲烷等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

NBL-1010型电子直线加速器 宁波超能科技股份有限公司；T9自动电位滴定仪、ME204T分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；RV-10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机 德国Thermo Scientific Sorvall公司；J-2高速组织捣碎机常州市金坛友联仪器研究所。

1.3 方法

1.3.1 EPP的制备

参考王欣宇[10]的提取方法制备EPP。经高效液相色谱检测，所得EPP总酚质量分数大于86.8%，主要成分如下：对苯二酚质量分数0.7%、倍儿茶素质量分数1.5%、鹅掌菜酚质量分数9.6%、表儿茶素质量分数55.3%、表没食子儿茶素没食子酸酯质量分数2.1%、表儿茶素没食子酸酯质量分数17.6%（图1）。

图1 实验室自制EPP的高效液相色谱图Fig. 1 Analysis of polyphenols in Enteromorpha prolifera by HPLC

1.3.2 样品预处理及分组

80 条新鲜海鳗洗净，沿脊骨剖开去鳃和内脏，自来水冲净血污，沥干。分成4 组。

对照（CK）组：将鳗鱼按液料比2∶1浸于腌制液（8 g/100 mL食盐溶液）中，4 ℃下腌制12 h后取出挂晾，低温（0～4 ℃）、慢风（2～3 m/s）风干72 h至水分质量分数约为40%，真空包装。

按CK组相同步骤进行样品预处理，然后分别浸于腌制液（含0.15% EPP和0.3% EPP的8 g/100 mL食盐溶液）中。取经CK组和经EPP预处理后真空包装的鳗鱼鲞各20 条，单层排列置于电子束辐照架上以3 kGy剂量进行电子束辐照处理，分别得到3 kGy电子束辐照（CK＋3 kGy）组、0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组和0.3%EPP＋3 kGy电子束辐照组。

4 组样品均于4 ℃下冷藏，分别在冷藏0、1、2、3、4、5、6 个月时取样（每组随机取3 条，取中段脊背部肉），测定其在贮藏过程中菌落总数、油脂氧化参数（硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值、过氧化值、酸价、碘价、p-AV以及脂肪氧合酶活力的变化。

1.3.3 菌落总数的测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[11]进行测定。

1.3.4 油脂氧化指标的测定

1.3.4.1 油样的提取

参考文献[12]的方法，并略做修改。将鳗鱼鲞剪碎，置于组织匀浆机中捣碎，随后将其于30 ℃下真空干燥至质量恒定，加入萃取溶剂（V（三氯甲烷）∶V（乙醇）＝2∶1），研磨提取3 次，合并滤液放于广口瓶中，用氮吹仪将萃取溶剂吹干，得到鳗鱼油样，经计算得到油样提取率约为8%。

1.3.4.2 TBARS值的测定

取1.3.4.1节制备油样，参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[13]进行测定，TBARS值以每千克鱼肉样品所含丙二醛质量表示，单位为mg/kg。

1.3.4.3 酸价的测定

取1.3.4.1节制备油样，参照GB 5009.229—2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》[14]中的第二法冷溶剂自动电位滴定法进行测定，以每克油脂样品所消耗的标准滴定溶液质量表示，单位为mg/g。

1.3.4.4 过氧化值的测定

取1.3.4.1节制备油样，参照GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[15]中的第一法滴定法进行测定，过氧化值用过氧化物相当于碘的质量表示，单位为g/100 g。

1.3.4.5p-AV的测定

参照GB/T 24304—2009《动植物油脂 茴香胺值的测定》[16]进行测定，p-AV以溶解试样的体积与样品的质量比表示，单位为mL/g。

1.3.4.6 碘价的测定

参照GB/T 5532—2008《动植物油脂 碘值的测定》[17]进行测定，碘价以每100 g油脂吸收碘的质量表示，单位为g/100 g。

1.3.5 脂肪氧合酶活力的测定

参考文献[18]的方法，并略作修改。

粗酶液的制备：称取5 g鳗鱼鲞样品剪成小块，放入研钵捣碎、研磨后转移到三角瓶中，加入15 mL磷酸盐缓冲液至样品全部浸没，待样品充分溶解后再于4 ℃、10 000 r/min离心20 min，收集上清液即为粗酶液。

酶反应底物溶液的配制：将4 mL 0.2 mol/L硼砂溶液与1 mL 0.05 mol/L硼酸溶液加入250 mL容量瓶中，混合，然后加入0.1 mL吐温-20和0.25 mL亚油酸，充分摇匀，使亚油酸充分分散在溶液中。为使配制的溶液清澈透明，在溶液中加入0.5 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液，摇动变清后用浓盐酸调节至pH 9.0，定容至250 mL。

脂肪氧化酶活力的测定：取0.8 mL酶反应底物溶液与0.2 mL粗酶液于试管中混匀，然后30 ℃水浴加热3 min，加入2 mL乙醇终止酶反应，再加入2 mL蒸馏水，摇动混匀后将溶液倒入石英比色皿，以无水乙醇作为空白溶液，用分光光度计于234 nm波长处测定溶液吸光度。以1 min内吸光度增加0.001为一个酶活力单位（U）。

1.4 数据处理与分析

每组实验均重复测定3 次，结果取平均值。用Origin 9.0软件绘制图形。

2 结果与分析

2.1 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间菌落总数的影响

由图2可知，CK组和3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞的菌落总数均随贮藏时间的延长呈现上升趋势。3 kGy电子束辐照处理鳗鱼鲞的初始菌落总数为0.5（lg（CFU/g）），到贮藏6 个月时，菌落总数为2.52（lg（CFU/g）），在整个贮藏期内，3 kGy电子束辐照组的菌落总数始终低于CK组。而0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组的初始菌落总数为0.1（lg（CFU/g）），当贮藏3 个月时，菌落总数出现略微增加，为0.2（lg（CFU/g）），且在整个贮藏期内，菌落总数始终不高于0.2（lg（CFU/g））。0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组的菌落总数在贮藏期内始终为0。由此可见，电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏过程中菌落总数增长有明显的抑制作用，这与戚文元等[19]对罗非鱼片的研究结果相一致，表明电子束辐照处理可以很好地杀灭水产品中病原微生物。而EPP结合电子束辐照处理对贮藏过程中鳗鱼鲞菌落总数的抑制作用则更为明显，0.15% EPP＋3 kGy电子束处理可以将菌落总数控制在很低的范围内，而0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照处理可以完全杀灭微生物。

图2 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间菌落总数的影响Fig. 2 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on total number of colonies in dried salted eel during storage

2.2 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间TBARS值的影响

TBARS值反映的是动物性油脂中不饱和脂肪酸氧化分解所产生的衍生物如丙二醛等与硫代巴比妥酸反应的结果。TBARS值检测方法较简单，而且一般与感官分析结果有很好的相关性，是最广泛的用于评价脂肪氧化程度的方法之一[20-21]。因此，TBARS值是检测动物和植物油脂等氧化酸败的重要方法，是判断鱼肉脂肪氧化程度的重要指标之一[22]。

由图3可知，所有组别鳗鱼鲞TBARS值在贮藏过程中均呈上升趋势，其中CK组上升速率最快，从贮藏初期的0.17 mg/kg上升到贮藏6 个月时的1.25 mg/kg。经3 kGy电子束辐照处理及EPP结合电子束辐照处理后的鳗鱼鲞TBARS值上升速率较为缓慢。贮藏初期，3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞TBARS值高于CK组，贮藏3 个月时TBARS值达到0.52 mg/kg，随后低于CK组。0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组和0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞在贮藏期内TBARS值均低于CK组，其中0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组的TBARS值略低于0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组，但两者差异不明显。辐照通过催化鱼肉产生自由基与氧气反应生成过氧化物，加速脂质自动氧化，引发链式反应，使鱼肉TBARS值上升[23]。而贮藏一段时间后TBARS值上升缓慢可能是由挥发性氧化物含量的减少引起的[2]。而加入EPP后鳗鱼鲞TBARS值降低是由于其活性羟基对样品中的游离自由基有较强的抑制和清除作用，能有效抑制脂肪酸的腐败，延长其货架期[24]。

图3 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间TBARS值的影响Fig. 3 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on TBARS value in dried salted eel during storage

2.3 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间酸价的影响

酸价是评价油脂氧化变质程度的一个重要指标。脂类分子经过热、光或酶的作用，在食品表面和内部发生氧化反应，释放出游离脂肪酸，而一些不饱和的脂肪酸很不稳定，继续分解为醛、酮、酸等，引起酸价升高，影响了油脂的稳定性。

如图4所示，在6 个月贮藏过程中4 组鳗鱼鲞油脂的酸价均有所上升。CK组、3 kGy电子束辐照组和0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞油脂的酸价均在贮藏前4 个月呈缓慢上升趋势，贮藏4 个月以后开始快速上升。其中，3 kGy电子束辐照组酸价上升幅度最大，贮藏6 个月时酸价达到1.41 mg/g，其次是CK组。而0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞油脂酸价在贮藏过程中先下降后缓慢上升，并且在整个贮藏过程中酸价变化幅度均较小，在贮藏6 个月时酸价为0.74 mg/g，相对于其他组酸价最低，油脂品质较好。以上结果表明，EPP结合电子束辐照处理具有抑制鳗鱼鲞油脂氧化的作用，且0.3% EPP＋3kGy电子束辐照能够明显降低鳗鱼鲞酸价，抑制油脂水解过程中游离脂肪酸的形成。而傅丽丽等[25]研究发现经电子束辐照后三文鱼酸价趋于平缓，没有明显的增加，这与本实验结果不一致。

图4 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间酸价的影响Fig. 4 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on acid value in dried salted eel during storage

2.4 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间碘价的影响

碘价可作为衡量油脂不饱和程度的指标[22]。在一定条件下，动植物食品所含油脂中不饱和脂肪酸的不饱和双键能够与碘、溴、氯发生卤素加成反应，由于油脂所含脂肪酸各有不同，与卤素发生加成反应的能力也不同，因此，用油脂对卤素的吸收能力表示油脂的不饱和程度。

如图5所示，各组鳗鱼鲞碘值在贮藏过程中均呈现下降趋势，3 kGy电子束辐照组在贮藏期间的碘价最低且下降速率较快，这是因为电子束辐照处理能够使油脂中的不饱和双键发生氧化聚合、氧化分解等反应，减少双键数量，使鳗鱼鲞中油脂的不饱和程度降低，导致碘值降低[26]。而相较于3 kGy电子束辐照组，EPP结合电子束辐照处理后鳗鱼鲞碘价在贮藏期内有所升高，与CK组较为接近。在整个贮藏期内，0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组碘价均高于0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组，说明EPP的添加会增加鳗鱼鲞在贮藏期内的碘价。

图5 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间碘价的影响Fig. 5 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on iodine value in dried salted eel during storage

2.5 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间过氧化值的影响

过氧化值可以用于衡量油脂的氧化变质程度。过氧化值越大说明油脂氧化越严重，食品品质越差。如图6所示，4 组鳗鱼鲞的油脂过氧化值都随着贮藏时间的延长而增加，但前3 个月均上升较缓慢，贮藏3 个月后上升速率加快，其中3 kGy电子束辐照组样品过氧化值的上升速率最快，贮藏6 个月时过氧化值达到0.58 g/100 g，这是因为过氧化物作为脂肪氧化的中间产物，电子束辐照的高能射线会加速脂肪氧化从而引起过氧化值上升[27]。而0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组油脂过氧化值上升速率略低于CK组，贮藏结束时两组间油脂过氧化值差异不显著。0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组油脂过氧化值在贮藏过程中始终保持在较低范围内，至贮藏6 个月时过氧化值仅为0.19 g/100 g。王敏等[28]研究发现无论多酚添加与否，大豆油过氧化值均会随贮藏时间的延长而增加，但添加板栗壳多酚可以延缓大豆油过氧化值的升高。由于EPP具有极强的抗氧化性，添加EPP可以有效抑制鳗鱼鲞油脂的氧化酸败，因此，EPP结合电子束辐照可以对油脂的氧化发挥良好的抑制作用，0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组处理效果不明显，其过氧化值与CK组接近，而0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照处理则对鳗鱼鲞油脂氧化的抑制作用更好。

图6 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间过氧化值的影响Fig. 6 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on peroxide value in dried salted eel during storage

2.6 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间p-AV的影响

p-AV表示油脂氧化过程中产生醛、醌、酮等中间产物的量。食品中油脂氧化后释放出游离脂肪酸，游离脂肪酸分解为醛、酮、酸等物质，其中醛类物质会破坏人体细胞的正常功能，具有致癌性。醛类物质能与p-茴香胺试剂发生反应，利用比色法计算出p-AV，可以得出食品油脂中醛类物质含量，p-AV越大，表明油脂的氧化劣变程度越严重。

如图7所示，4 组鳗鱼鲞的油脂p-AV都随贮藏时间的延长而上升，其中CK组鳗鱼鲞p-AV值上升幅度最大，其初始p-AV为3 mL/g，贮藏6 个月后，p-AV达到25 mL/g。与CK组上升幅度较为接近的是3 kGy电子束辐照组，其在贮藏前5 个月p-AV均高于CK组，而在贮藏第6个月时低于CK组，这是因为电子束辐照可以减缓脂肪酸的分解速率，使p-AV增速变缓。而0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组和0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组的p-AV上升速率均较慢，且这两组的p-AV除初始值外其余贮藏时间均低于CK组。这与胡逸涵等[29]在鱼油贮藏期间添加植物多酚能够降低鱼油样品p-AV的结果一致。说明EPP结合电子束辐照处理能够使鳗鱼鲞油脂氧化裂变程度得到进一步的缓解，较高浓度的EPP对鳗鱼鲞油脂氧化的延缓作用更加明显。

图7 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间p-AV的影响Fig. 7 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on p-AV in dried salted eel during storage

2.7 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间脂肪氧合酶活力的影响

脂肪氧合酶是一种氧化还原酶，专门催化含有顺,顺-1,4-戊二烯结构的不饱和脂肪酸以及酯类物质发生氢过氧化反应，通过在分子内加氧，产生具有共轭双键的多元不饱和脂肪酸，是一种含非血红素铁的蛋白。脂肪酸被脂肪氧合酶氧化作用后产生的许多酸、醛、酮、酯等小分子物质，特别是含有共轭双键的氢过氧化衍生物，会使食品风味、色泽等发生劣变和营养物质流失，对鳗鱼鲞的品质造成不良影响。

由图8可知，4 组鳗鱼鲞脂肪氧合酶活力在贮藏过程中均呈先上升后下降的趋势，CK组、3 kGy电子束辐照组的脂肪氧合酶活力在贮藏3 个月时达到最高，分别为83 U/mg和65 U/mg。而0.15% EPP＋3 kGy电子束辐照组和0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组的脂肪氧合酶活力均在贮藏4 个月时达到最高，分别为69 U/mg和73 U/mg。贮藏过程中3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞脂肪氧合酶活力始终低于其他3 组，而EPP结合电子束辐照处理的脂肪氧合酶活力介于CK组和3 kGy电子束辐照组之间，且0.3% EPP处理较0.15% EPP处理脂肪氧合酶活力稍高，这是因为EPP作为一种植物多酚，具有良好的脂肪氧合酶抑制活性，酚羟基的数目与位置对植物多酚的脂肪氧合酶抑制活性具有显著性影响[30-31]。

图8 EPP协同低剂量电子束辐照对鳗鱼鲞贮藏期间脂肪氧合酶活力的影响Fig. 8 Effect of EPP combined with low-dose electron beam irradiation on lipoxygenase activity in dried salted eel during storage

3 讨 论

从理化指标来看，仅电子束辐照处理和EPP结合电子束辐照处理均可以延长鳗鱼鲞的贮藏期，这说明EPP具有有效的油脂抗氧化作用，特别是0.3% EPP＋3 kGy电子束辐照组鳗鱼鲞的酸价、过氧化值和p-AV均最低，表明高浓度的EPP和低剂量电子束辐照协同作用可以很好地延缓或抑制油脂的氧化作用。鳗鱼鲞处于真空包装袋中，3～5 kGy低剂量电子束辐照促进了油脂和蛋白与鱼体表面和内部间隙少量氧气分子发生适度氧化反应，同时电子束辐照处理产生的过量自由基被EPP及时中和，阻止电子束辐照对鳗鱼鲞负作用的产生。低剂量电子束辐照导致蛋白质和油脂的适度氧化和裂解有利于改善鳗鱼鲞食用品质，提高鲜味肽和愉悦性挥发性风味物质的含量。在EPP和电子束辐照协同处理后，鳗鱼鲞油脂氧化指标的变化幅度均低于其他组。王文亮等[32]发现经辐照处理后，食品中的油脂更容易发生氧化、褐变等，并产生令人不悦的异味，降低食品品质，这与本实验中单独用3 kGy电子束辐照处理鳗鱼鲞的结果一致。乔宇等[3]通过研究发现，在贮藏过程中植物多酚协同电子束辐照组鸭掌的TBARS值低于辐照对照组，植物多酚可以延缓鸭掌的脂质氧化，这与本实验结果一致。李锋等[33]发现EPP中含有大量的生物活性物质，有很强的清除活性氧自由基的能力。龙明秀等[34]发现不同植酸和茶多酚复合使用可以较好地保持辐照卤鸡翅的风味和品质，延长保质期。张英[21]发现EPP不仅具有抗氧化作用，还可以用作防腐剂、杀菌剂等。

本实验研究了EPP及低剂量（3 kGy）电子束辐照处理对鳗鱼鲞微生物和油脂氧化的影响。结果表明，随着贮藏时间的延长，鳗鱼鲞的菌落总数、TBARS值、酸价、过氧化值和p-AV总体呈现增加的趋势，碘价呈下降的趋势，脂肪氧合酶活性呈先上升后下降的趋势。而经3 kGy电子束辐照后，由于鳗鱼鲞发生氧化反应，释放游离氨基酸，从而导致酸价、过氧化值、p-AV的升高以及碘价的下降。而添加EPP能够抑制鳗鱼鲞的脂肪氧化作用，使其保质期得到延长，0.3% EPP结合3kGy电子束辐照处理能够很好地控制贮藏过程中鳗鱼鲞的品质劣变，从而有效延长冷藏鳗鱼鲞的货架期，保持鳗鱼鲞的风味品质。