米糠蛋白改善大鼠脂质代谢作用及机制研究

王吉力特，雍雅萍，苏 靖，夏美茹，刘 聪（河套学院农学系，内蒙古巴彦淖尔 015000）

大米是世界上三大主要谷物之一，也是食用人口最多、种植历史最悠久的农作物产品[7]。米糠是稻谷加工的副产品之一，是糙米经碾米后得到的种皮、果皮、糊粉层和珠心层的混合物，富含蛋白质12%～16%，可溶性蛋白质约占70%，与大豆蛋白相近，其氨基酸组成与联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）建议的模式接近，营养价值可与鸡蛋蛋白相媲美[8−9]。米糠蛋白是已知谷物中过敏性最低的一种蛋白质，多数植物性蛋白和动物性蛋白中都含有抗营养因子，往往会引起过敏或中毒等反应，而米糠中蛋白质不含类似致敏因子。但是，人们却很少关注米糠蛋白影响健康的潜在价值。现已有大米蛋白[10]和糙米[11]降低血清胆固醇作用的相关报道，但米糠蛋白降胆固醇作用的报道却很少，作用机制还有很多不明之处。本研究采用高血脂模型大鼠作为试验对象，体外模拟人体胃肠消化道环境试验，对米糠蛋白质改善脂质的代谢作用进行评价，并对其调控机理进行探讨，旨在为其高质化开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar 大鼠 5 周龄体重（90～ 100 g），日本SLC 公司；标准饲料（MF） 日本东方酵母工业株式会社；酪蛋白 日本明治乳业株式会社（Casein，纯度82.75%）；米糠蛋白（Rice Bran Protein，纯度81.54%）、糙米蛋白（Brown Rice Protein，纯度86.80%）、大米蛋 白（White Rice Protein，纯度78.80%） Oryza Oil &Fat Chemical Co.Ltd.公司；[4-14C]-胆固醇、[羰基-14C]牛黄胆酸钠盐 美国PerkinElmer Life Sciences；胆固醇 日本片山化学；牛磺胆酸钠、油酸、磷脂酰胆碱等试剂 美国Sigma 公司；总胆固醇试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、甘油三酯试剂盒、总胆汁酸试剂盒 日本和光纯药工业株式会社。

U-2910 紫外可见分光光度计 日本日立公司；2900TR 液体闪烁仪 美国Perkinelmer 公司；GC-14A 气相色谱仪 日本岛津公司；恒温水浴振荡器日本 Yamato 公司；Optima MAX TLX 台式超高速离心机 美国贝克曼公司；VP-5S 超声波破碎仪日本Taitec 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物实验 实验大鼠适应实验室环境3 d 后，将24 只大鼠按体重随机分为4 组，酪蛋白（CAS）作为对照组，饲料中添加20%酪蛋白作为蛋白质来源；米糠蛋白组（RBP），饲料中添加5%米糠蛋白+15%酪蛋白作为蛋白质来源；糙米蛋白组（BRP），饲料中添加5%糙米蛋白+15%酪蛋白作为蛋白质来源；大米蛋白组（WRP），饲料中添加5%大米蛋白+15%酪蛋白作为蛋白质来源。每组6 只动物，在代谢饲养笼中单笼饲养，自由摄食含高胆固醇的高脂饲料，详细成分见表1。实验期间室温（22±2）℃，每12 h 明暗交替，自由饮水，每2 d 称1 次体重，准确记录5～6 d 和18～19 d的进食量。实验第21 d，大鼠禁食不禁水18 h，用乙醚麻醉后，心脏采血处死，迅速取肝脏保存于−20 ℃，血清离心分离（3000 r/min，10 min，4 ℃）后−20 ℃保存备用。

表1 试验饲料成分（g/100 g）Table 1 Composition of experimental diets (g/100 g)

1.2.2 血清及肝脏脂质含量测定 血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、血清高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、血清甘油三酯（triglyceride，TG）水平。按试剂盒说明进行测定。血清低密度脂蛋白胆固醇+极低密度脂蛋白胆固醇（low density lipo-protein cholesterol+very low density lipoprotein cholesterol，LDL-C+VLDLC）含量，依据以下公式进行计算：

LDL-C+VLDL-C=TC -HDL-C

动脉硬化指数（atherogenic index，AI）的计算：

(3) 利用硅-焓方程法与硅-焓图解法估算研究区地热水中混入冷水的比例，其中地热井水中冷水混入比例为39.47%～70.19%，初始温度为182.36 ℃～212.22 ℃，温泉中冷水混入比例为63.33%～86.93%，初始温度为172.58 ℃～258.23℃，研究结果发现，随地热井深度增加，混入冷水比例大幅降低，但计算的初始温度较实际温度仍然偏高。

AI=（TC-HDL-C）/ HDL-C

按照Folch 等[12]的方法提取肝脏总脂质水平，并参照试剂盒说明，测定肝脏胆固醇及其甘油三酯水平。

1.2.3 粪中类固醇含量测定 收集实验最后3 d的粪便，60 ℃恒温干燥72 h 后，迅速准确称重记录。粪便总胆汁酸排泄量，按照Bruusgaard 等[13]报道的方法提取并参照试剂盒说明，进行测定。按照Malchow-Moller 等[14]报道的方法，用GC-14A 气相色谱（日本岛津）测定粪便中性类固醇含量。总类固醇含量按以下公式计算：

总类固醇（mg/3 d）=胆汁酸（mg/3 d）+中性粪固醇（mg/3 d）

中性粪固醇（mg/3 d）=胆固醇（mg/3 d）+甾烷醇（mg/3 d）

1.2.4 抑制胆固醇胶束溶解度测定 参考Satoshi等[15]的方法测定了酪蛋白、米糠蛋白、糙米蛋白和大米蛋白的体外胆固醇胶束溶解度抑制率。[14C]标记的胶束溶液1 mL，由以下浓度的试剂制备并通过超声处理3 min 进行混合：0.74 kBq [4-14C]-胆固醇，0.1 mmol/L 胆固醇溶液，6.6 mmol/L 牛磺胆酸钠溶液，1 mmol/L 油酸溶液，0.6 mmol/L 磷脂酰胆碱溶液，0.5 mmol/L 单油酸甘油酯和15 mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）。37 ℃恒温振荡孵育24 h 后1 mL 胶束溶液添加到各10 mg 蛋白样品中，最终浓度为10 mg/mL，通过超声波处理3 min 后，再恒温振荡孵育60 min，并在37 ℃、100000×g 条件离心60 min。收集上清液，通过液体闪烁计数器测定[14C]-胆固醇水平。做4 次平行试验，取平均值。计算公式如下：

胶束溶解度（%）=上清液胆固醇含量（dpm）/ 胶束原液胆固醇含量（dpm）×100

1.2.5 牛磺胆酸结合能力测定 参考Nagaoka 等[15]的方法，取7 种不同浓度的酪蛋白和米糠蛋白后加入2 mL 含1.85 kBq 牛磺胆酸钠盐[羰基-14C]的混合液（0.1 mmol/L），最终浓度为5、10、20、40、60、80 和100 mg/mL。37 ℃恒温振荡消化120 min 后，在37 ℃、15000 r/min 条件离心15 min。上清液放射性含量通过液体闪烁计数法测定。由牛磺胆酸盐总量与未结合的胆酸盐的差值计算不同浓度酪蛋白和米糠蛋白的结合率。做3 次平行实验，取平均值。计算公式如下：

胆汁酸结合率（%）=（A0−A）/ A0×100

式中，A0：总牛磺胆酸钠含量（dpm）；A：上清液未结合牛磺胆酸钠含量（dpm）。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 稻谷源不同蛋白对大鼠生长性能的影响

由表2 可知，实验期间4 组大鼠的体重均有增加，RBP 组的大鼠体重增加量和2 次采食量与CAS 组、BRP 组和WRP 组无显著性差异（P>0.05），表明各试验组的食物蛋白质对大鼠生长性能的作用效果无显著差异（P>0.05）。

表2 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠生长性能的影响（n=6）Table 2 Effects of different proteins from rice on growth performance in Wistar rats (n=6)

2.2 稻谷源不同蛋白对大鼠血清脂质水平的影响

由表3 可见，对比CAS 组，RBP 组的大鼠血清TC 水平显著降低（P<0.05），主要反映在LDL+VLDL-C 含量的显著降低（P<0.05）。对比CAS 组，BRP 和WRP 组的血清TC 水平无显著差异（P>0.05）。21 d的饲养，只有RBP 组大鼠的动脉硬化指数（AI）较CAS 组显著降低了45.75%（P<0.05）。对比CAS，RBP、BRP 和WRP 大鼠血清TG 水平无显著差异（P>0.05）。Zhang 等[9]研究表明，高脂模型仓鼠试验中，大米蛋白及糙米蛋白与酪蛋白相比较无显著降低血清TC 水平。而脱脂米糠蛋白在高脂模型小鼠试验中，显著降低血清LDL-C 水平（P<0.05），并显著促进了粪便TC 和胆汁酸排泄量[16]。该结果与本实验结果一致。综合以上试验结果表明，RBP 能够显著降低大鼠血清非高密度胆固醇水平（40.81%）（P<0.05），对动脉粥样硬化可能具有一定的预防作用。

表3 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠血清脂质水平的影响（n=6）Table 3 Effects of different proteins from rice on serum lipids levels in Wistar rats (n=6)

2.3 稻谷源不同蛋白对大鼠肝脏脂质水平的影响

由图1 可见，对比CAS 组，RBP、BRP 和WRP组的肝脏胆固醇水平有降低倾向但无显著差异（P>0.05），肝脏甘油三酯水平同样在RBP 组中有降低倾向（图2）。对比CAS 组，RBP 组的肝脏总脂质水平显著降低了11.83%（P<0.05）（图3）。该结果表明，饲料中的添加量同等条件下，相比于大米蛋白和糙米蛋白，米糠蛋白可一定程度改善肝脏胆固醇代谢，抑制肝脏脂肪的蓄积，有助于预防脂肪肝。Tong[6]等研究表明，燕麦蛋白通过降低高脂模型豚鼠肝脏胆固醇水平，改善肝脏胆固醇代谢。Varun 等[17]研究发现，米糠蛋白的胃蛋白酶及胰蛋白酶水解产物具有显著降低体外胆固醇胶束溶解度能力、结合胆汁酸能力和降低3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶（HMGCR）作用，且分子量分布在25～45 kDa 之间，通过反向高效液色谱和液质联用图谱发现三个主要峰的保留时间13.10、15.91 和22.07 min，质量范围在120～903 m/z之间。结合以上所述，米糠蛋白在体内分解后的一种或复数活性肽发挥了改善脂质代谢作用。

图1 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠肝脏胆固醇水平的影响（n=6）Fig.1 Effects of different proteins from rice on hepatic cholesterol levels in Wistar rats（n=6）

图2 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠肝脏甘油三酯水平的影响Fig.2 Effects of different proteins from rice on hepatic triglyceride levels in Wistar rats

图3 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠肝脏总脂质水平的影响Fig.3 Effects of different proteins from rice on hepatic total lipids levels in Wistar rats

2.4 稻谷源不同蛋白对大鼠粪固醇排泄量的影响

由表4 可见，对比CAS 组，粪干重除了WRP 组显著增加外（P<0.05），RBP 组或BRP 组无显著性差异（P>0.05）。对比CAS 组，RBP、BRP 或WRP 组粪中胆汁酸排泄量均显著增加（P<0.05）。对比CAS 组，RBP、BRP 或WRP 组粪中中性类固醇排泄量没有显著增加（P>0.05），但是粪甾烷醇分别增加279.77%、171.67%或168.10%，具有显著性差异（P<0.05）。体内胆固醇的排出一般是通过转化为胆汁酸的形式，胆汁酸大部分会被肝门静脉血管重新吸收，而未被吸收的胆汁酸则直接通过粪便排泄[18]。胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）是该反应的关键酶。Spady 等[19]研究发现，CYP7A1 过表达可改善小鼠高胆固醇血症和动脉粥样硬化。在本实验中米糠蛋白能促进粪便胆汁酸排泄量的原因不明确，因此今后试验中应探讨米糠蛋白对大鼠肝脏CYP7A1 基因表达量的影响。

表4 稻谷源不同蛋白对Wistar 大鼠粪及粪固醇排泄量的影响（n=6）Table 4 Effects of different proteins from rice on feces and feces sterol excretion in Wistar rats（n=6）

2.5 抑制胆固醇胶束溶解度的测定

由图4 可知，在体外模拟人体胃肠消化道环境中，比较CAS 组，RBP、BRP 或WRP 组胆固醇胶束溶解度显著降低（P<0.05），且其中RBP 组抑制胶束溶解度能力最强。膳食由来的游离胆固醇与胆酸盐复合成可溶性胶束，透过细胞膜进入肝肠循环。多数研究通过体外胆固醇胶束溶解度试验筛选具有降血脂作用的活性物质。包小兰等[20]以亚麻籽分离蛋白为原料，通过体外胆固醇胶束溶解度试验制备了具有较高降胆固醇活性的亚麻籽肽。Zhang 等[21]使用不同的蛋白酶制备了米糠蛋白水解物（RBPH），并研究其降低胆固醇胶束溶解度作用。数据表明，碱性蛋白酶解产物中的疏水性蛋白能置换胶束溶液中的胆固醇从而显著降低其溶解性。结合上述研究结果，本研究中米糠蛋白疏水性蛋白或体内消化后的活性肽等性成分抑制了肠道的胆固醇吸收，促进了其粪便中的排泄量。

图4 稻谷源不同蛋白对胶束溶解性的影响（n=4）Fig.4 Effects of different proteins from rice on cholesterol micellar solubility（n=4）

2.6 牛磺胆酸结合能力测定

由图5 可知，在体外模拟人体胃肠消化道环境中，米糠蛋白组在不同浓度10、20、40、60、80、100 mg/mL 水平分别高度显著或者极显著高于相对应的酪蛋白组（P<0.01 或P<0.001），且结合程度随加入量的增加而增加。由此推测，米糠蛋白可以通过与胆汁酸的结合作用减少脂肪在胃肠内的消化吸收，具有一定的降脂功能。

图5 米糠蛋白对牛黄胆酸结合能力的影响（n=3）Fig.5 Effects of rice bran protein on taurocholic acid-binding capacity（n=3）

3 讨论与结论

胆固醇是胆汁酸、类固醇类激素和VD 合成的底物，也是细胞膜的重要组成部分，但血清胆固醇水平过高又会引起许多疾病。许多研究表明，多种植物源蛋白质具有改善脂质代谢的作用。Anderson 等[22]指出每天摄取25 g 大豆蛋白会分别降低血清LDLC、TC 及其TG 水平。也有研究表明，连续5 周每天摄取20 g 大豆蛋白会有效降低高危中年男性的缺血性心脏病风险[23]。Elisa 等[24]研究发现，含有38.1%蛋白质的米糠酶分解产物可显著降低大鼠血清胆固醇水平。但是在该研究中因米糠蛋白或水解产物含量较低而无法明确其改善胆固醇代谢作用及其机制。本研究中将各组高脂饲料的蛋白含量统一化，即酪蛋白组添加量20%、米糠蛋白组（15%酪蛋白+5%米糠蛋白）、糙米蛋白组（15%酪蛋白+5%糙米蛋白）大米蛋白组（15%酪蛋白+5%大米蛋白），观察比较高胆固醇饮食模式下米糠蛋白、大米蛋白和糙米蛋白对大鼠脂质代谢的影响。结果表明，与大米蛋白和糙米蛋白相比较米糠蛋白可改善大鼠脂质代谢，显著降低血清胆固醇水平，促进胆汁酸的排泄量。

胆汁酸是肝脏内胆固醇衍生产物，经分泌进入动态平衡的胆汁酸池，再经盲肠末端被重吸收从而进入肠肝循环。许多研究显示，一些食品成分能与胆汁酸结合，抑制胆固醇胶束溶解度，将胆汁酸排出体外，促使胆固醇不断转化为胆汁酸以维持胆汁酸池的动态平衡，从而降低血液中胆固醇含量，起到降血脂的效果[25−26]。

因此在研究中利用体外模拟人体胃肠消化道环境试验，测定了米糠蛋白及其他蛋白源对胆固醇胶束溶解度抑制率和胆汁酸结合能力。预实验结果发现，除了米糠蛋白同等浓度（10 mg/mL）的其他蛋白质（酪蛋白、糙米蛋白、大米蛋白）均无显著结合牛磺胆酸的能力。为了更好地解释米糠蛋白能显著抑制胆固醇胶束溶解度机理，本试验只选择了梯度浓度米糠蛋白，测定其结合牛磺胆酸的能力。实验结果显示，米糠蛋白能显著降低胆固醇胶束溶解度(P<0.05)，与牛磺胆酸也有显著的结合能力(P<0.05)。结合动物试验结果和体外试验结果，能充分说明米糠蛋白在体内与胆汁酸相结合，抑制其在肠道的吸收，增加其粪便中的排泄量，最后达到降血脂的作用。

本论文中使用高脂模型大鼠，研究了高纯度米糠蛋白对脂质代谢调控的相关研究，从体内外水平阐释了其降血脂作用，为未来以米糠蛋白为原料，研发功能性食品的可行性提供了科学依据。今后应更深层探究米糠蛋白在体内消化、吸收后对胆固醇代谢相关基因表达水平的影响。