辣木叶茶4 种发酵方式不同发酵阶段化学成分与品质变化及其相关性分析

郭刚军，胡小静，徐 荣，马尚玄，张祖兵，何 锐，李海泉,

（1.云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100；2.文山学院化学与工程学院，云南文山 663000）

辣木（Moringa oleiferaLam.）为辣木科辣木属植物，属小乔植物，常绿或半落叶，原产于印度，又称为奇树，鼓槌树，广泛种植在亚洲、非洲和拉丁美洲的热带和亚热带地区[1−2]。辣木富含蛋白质、碳水化合物、VA、叶酸、泛酸、钙、铁、硒等多种营养素，被称为“营养大全”[3−4]，还含有类胡萝卜素、酚类、黄酮类、植物甾醇、苷类、多糖、生物碱、有机酸类、细胞分裂素等多种功能成分[5−7]。辣木在国外有“奇迹树”、“母亲最好的朋友”和“天然药柜”等美称[4]。现代药理学研究发现，辣木具有抗氧化、解痉、抗病毒、抗菌消炎、抗癌、降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤、抑制DNA 氧化损伤、调节肠道微生物、抗溃疡等多种生物活性[8−10]。2012 年，我国卫生部第19 号公告批准辣木叶作为新食品原料，同年辣木被中国绿色食品发展中心认定为“国家首推绿色食品”[2]。

辣木茶是以辣木鲜叶和茎为原料，采用绿茶工艺加工制成的高档养生保健茶，外形翠绿，茶性温和，易冲耐泡，滋味滑口，汤色黄绿明亮，叶底柔软完整[11]。固态发酵是指利用微生物在潮湿的没有自由流动水的固体基质上生长代谢的技术，具有高效、经济且产物产率较高的特点，在食品加工中被广泛利用[12−13]。它通过产生一系列的酶类，发生氧化、聚合、缩合等复杂的酶促反应，产生生物活性物质，提高产品的营养与功能[14]。目前，有关辣木发酵方面的研究有张云娟等[15]采用毛霉对辣木叶粉进行了固态发酵，分析了其主要营养成分、相关酶活力及抗氧化活性的变化；石鸿辉等[14]利用黑曲霉、产肮假丝酵母、枯草芽胞杆菌为发酵菌种对辣木茎叶粉进行固态好氧发酵，分析了对其营养价值与抗氧化活性的影响；李倩等[16]应用植物乳杆菌S35 菌株对辣木叶提取液进行了液态发酵，研究了其发酵过程中pH、可溶性固形物、总酸、还原糖、黄酮、多酚、有机酸及清除DPPH 自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的活性变化，而有关利用微生物固态发酵辣木叶茶的研究尚不多见。

本研究以自制辣木叶茶为原料，对其进行自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵，分析不同发酵阶段样的感官品质、化学成分及色泽指标变化，探寻它们之间的相关性，为辣木叶的深加工及开发利用提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木鲜叶 采自云南省热带作物科学研究所中国-古巴辣木科技合作实验基地；酵母（Saccharomyce scerevisiae） 安琪酵母股份有限公司；根霉 广西博白县沙河镇大石酒曲厂；黑曲霉（Aspergillus brasiliensis） 上海鲁微科技有限公司；牛肉浸粉、蛋白胨、芦丁、牛血清蛋白、葡聚糖、咖啡因等标准品 中国药品生物制品检定所；考马斯亮蓝G250 上海迈坤化工有限公司；硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、浓盐酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化钠、浓磷酸、蒽酮、浓硫酸、碱式乙酸铅、浓盐酸、碳酸氢钠、草酸等均为分析纯 中国医药集团有限公司。

6CST-30 型茶叶杀青机、6CR-35 型茶叶揉捻机浙江上洋机械有限公司；BSC-400 型恒温恒湿培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MJ33 型快速水分测定仪 上海精科实验仪器有限公司；SPX-250-ZZ 型生化培养箱 上海跃进医疗器械有限公司；BGZ-240 型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FA1004 型分析天平 杭州汇尔仪器设备有限公司；UV754N 型紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；HH-8 型数显恒温水浴锅 上海和晟仪器科技有限公司；SC-80I 型色差计 北京京仪康光光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶茶原料的制备 采用杀青机将辣木叶鲜叶杀青至叶片失去光泽，叶色暗绿，叶质柔软、萎卷，青草气散失，显露清香，再用揉捻机按照轻-重-轻与抖揉结合的原则反复揉捻30 min，然后在80 ℃电热鼓风干燥箱中将其干燥至含水量4%～6%，冷却，挑拣叶柄，制得辣木叶茶原料，备用[17]。

1.2.2 菌种的活化与培养

1.2.2.1 酵母菌 取10 g 果酒专用酵母加100 mL 浓度5%葡萄糖溶液，在温度36 ℃的培养箱中活化0.5 h，培养液上层冒泡，表明酵母菌活力较好，然后添加4400 mL的无菌水稀释，备用。

1.2.2.2 根霉菌 取麦麸添加根霉300 g 加400 mL无菌水浸泡12 h，每0.5 h 搅拌一次，用灭菌滤布过滤，加无菌水稀释至4500 mL 备用。

1.2.2.3 黑曲霉 取1 g 黑曲霉冻干粉加入5 mL 营养肉汤培养基，在温度33～36 ℃下培养30 h，加入5%葡萄糖1500 mL 培养28～30 h。然后取其中的300 mL 加4200 mL 无菌水稀释，备用。

1.2.3 辣木叶茶的固态发酵 分别取5 kg 辣木叶茶4 份，分别喷洒4500 mL 无菌水、酵母培养液、根霉培养液与黑曲霉培养液进行自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵，翻匀，在温度45 ℃、相对湿度85%恒温恒湿条件下发酵16 d，每4 d 翻堆1 次并取样，测定其化学成分含量与色泽指标，并进行感官评价[18]。

1.2.4 辣木叶茶及不同发酵阶段样的色泽测定 分别取3 g 辣木叶茶及不同发酵阶段样，加沸水150 mL，浸泡5 min，抽滤，制得茶汤，然后采用SC-80I 全自动色差计在10 °视场、D65 光源条件下，对茶汤的色差值进行测定。试验采用的是Hunter Lab 色系统，此系统中，L*是明度变量，a*和b*是色品坐标，ΔL*，Δa*，Δb*均表示色差值，ΔE*表示总色差值。L*大表示偏白，L*小表示偏黑；a*大表示偏红，a*小表示偏绿；b*大表示偏黄，b*小表示偏蓝[19−20]。

1.2.5 辣木叶茶及不同发酵阶段样的感官评价 在光线充足、无异味的品评室内对辣木叶茶及不同发酵阶段样进行感官评价。评价方法：由6 名从事辣木叶加工的专业人员评出相应的得分，取平均值。评价指标参考GB/T 22111-2008《地理标志产品普洱茶》，包括：色泽（10 分）、净度（10 分）、汤色（15 分）、香气（30 分）、滋味（25 分）、叶底（10 分）[21−22]。

1.2.6 辣木叶茶及不同发酵阶段样化学成分的测定多酚、水浸出物含量测定参考文献[23]，采用酒石酸铁比色法、GB/T 8305-2013 进行；黄酮含量测定参考文献[24]，采用三氯化铝比色法进行；多糖含量测定参考文献[25]，采用苯酚-硫酸比色法进行；可溶性蛋白含量测定参考文献[26]，采用考马斯亮蓝比色法进行；咖啡碱含量测定参考文献[27]，按GB/T 8312-2013 进行。

1.3 数据处理

数据采用SAS 9.2 软件处理，应用方差分析与邓肯氏法进行显著性分析，以P<0.05 为差异具有统计学意义；采用皮尔森法进行相关性分析；运用REG过程进行多元线性回归分析。实验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 辣木叶茶不同发酵阶段样的色泽分析

由表1 可知，辣木叶茶在自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵的不同阶段，其色泽发生了明显的变化。酵母发酵与根霉发酵茶样的L*值随翻堆次数的增加而降低，其均在四翻样降到最低；自然发酵与黑曲霉发酵随翻堆次数增加呈先降低后升高的趋势，其均在三翻样降到最低。不同方式发酵茶样的L*值均低于辣木叶茶，表其汤色不如辣木叶茶明亮。成洲等[28]研究表明，茶汤的L*值与品质审评评分呈极显著负相关，这是与本研究结果是一致的。

表1 辣木叶茶不同发酵阶段样色泽分析Table 1 Color analysis of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

自然发酵与黑曲霉发酵辣木叶茶翻堆样△E*值随翻堆次数增加而先增加后降低，酵母发酵逐渐上升。四种发酵方式茶样的a*值与△a*均随翻堆次数的增加而上升，自然发酵、酵母发酵与根霉发酵茶样的b*值与△b*值总体随翻堆次数增加而上升，黑曲霉发酵随翻堆次数的增加呈先降低后升高的趋势。四种发酵方式的四翻样中，黑曲霉发酵样的△E*值、a*值与△a*值均最大，分别为36.42、15.66 与12.20。结合辣木叶茶不同发酵阶段样感官品评与化学成分变化结果，这表明本研究随着发酵的进行，辣木叶茶中的红褐色色素类物质被大量生成，其含量大幅增加，形成辣木叶发酵茶特有的品质特征，推测辣木红褐色素的形成是在微生物分泌酶、“呼吸热”以及渥堆湿热作用下，通过氧化多酚、黄酮等酚类物质，并偶联、缩合、聚合蛋白质、多糖、咖啡碱等物质的方式形成，是辣木叶茶发酵样汤色的主要呈色物质[29−30]。

2.2 辣木叶茶不同发酵阶段样感官品质分析

由表2 可知，不同方式发酵的辣木叶茶在不同发酵阶段，其色泽、净度、汤色、香气、滋味与叶底等感官指标发生了明显变化。其中，自然发酵与酵母发酵干茶样外观色泽由最初的墨绿色变为灰绿色，根霉发酵与黑曲霉发酵茶变为褐色。各种发酵方式干茶样的净度与汤色随翻堆次数的增加而提高，其中黑曲霉发酵四翻样最好。与辣木叶茶相比，经发酵后，自然发酵与黑曲霉发酵茶样的香气有了较大提升，酵母发酵与根霉发酵茶样后期也有所提升，但前期较差。其中，黑曲霉发酵四翻茶样的香气品质陈香纯正，感官得分最高。不同方式发酵茶样的滋味品质均随翻堆次数增加而有所提升，自然发酵、酵母发酵与黑曲霉发酵茶样开始阶段为酸涩或苦涩，发酵到后期转变为醇和回甘，其中黑曲霉发酵茶样的滋味品质醇和回甘，得分最高，根霉发酵后茶叶虽品质也有提升，但到后期还是有微酸味。各茶样的叶底品质随翻堆次数的增加而提高，发酵到后期，自然发酵与根霉发酵茶样转变为黄褐色，酵母发酵与黑曲霉发酵转变为黑褐色，但总体比辣木叶茶略差。随着翻堆次数的增加，自然发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵茶样的综合感官品质逐渐提升，酵母发酵呈先上升后下降的趋势，所有茶样中，黑曲霉发酵四翻样感官品质最好，综合得分最高。

表2 辣木叶茶不同发酵阶段样感官评价结果Table 2 Sensory evaluation of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

2.3 辣木叶茶不同发酵阶段化学成分变化分析

由图1 可知，自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵的辣木叶茶在不同的发酵阶段，化学成分发生了大幅度变化，形成了辣木叶发酵茶特有的品质特征。

图1 辣木叶茶不同发酵阶段样化学成分含量变化Fig.1 Changes of contents of chemical constituents of Moringa oleifera leaf tea samples in different fermentation stages

在不同的发酵阶段，辣木叶茶不同方式发酵样多酚含量总体随翻堆次数的增加而降低，其中酵母发酵降低最多，其四翻样含量最低，仅为8.59 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），其次为黑曲霉发酵，其三翻样含量最低，为13.07 mg/g，与四翻样无显著性差异（P>0.05），根霉发酵下降最慢。

辣木黄酮含量随翻堆次数的增加而降低，其中酵母发酵下降最多，其四翻样含量最低，为7.27 mg/g，与三翻样无显著性差异（P>0.05），其次为黑曲霉发酵，其四翻样含量最低，为10.99 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），根霉发酵下降最少，发酵程度最低。

辣木可溶性蛋白含量总体随翻堆次数的增加而升高，其中酵母发酵增加相对较多，其四翻样含量最高，为19.63 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），其次为黑曲霉发酵，其四翻样含量最高，为16.46 mg/g，与一翻、三翻样无显著性差异（P>0.05），根霉发酵增加最少，发酵程度最低。

辣木多糖含量总体随翻堆次数的增加而降低，其中酵母发酵降低最多，其三翻样含量最低，为11.79 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），其次是自然发酵，其四翻样含量最低，为23.05 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），根霉发酵下降最少，发酵程度最低。

辣木咖啡碱含量总体随翻堆次数的增加呈先增加后减少的趋势，其中自然发酵增加相对较多，其二翻样含量最高，为3.41 mg/g，与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），其次为黑曲霉发酵，其二翻样含量最高，为3.11 mg/g，与其三翻样无显著性差异（P>0.05），根霉发酵增加较少，发酵程度较低。

辣木叶茶不同方式发酵样水浸出物含量随翻堆次数增加呈先减少后增加的趋势，均为发酵到第三翻时含量最低，其中酵母发酵下降相对较多，其三翻样含量为239.20 mg/g，其次是自然发酵，其三翻样含量为312.10 mg/g，均与辣木叶茶及其他翻堆样存在显著性差异（P<0.05），根霉发酵下降最少，发酵程度最低。

何国藩等[31]从普洱茶渥堆叶片组织的显微结构变化证明，微生物分泌的多种酶类及代谢产生的热量对茶叶内含物的氧化还原反应以及品质起到重要的作用。黑茶渥堆发酵过程中，茶多酚、儿茶素及氨基酸茶黄素、茶红素的含量都呈下降趋势，茶褐素呈上升趋势，而可溶性糖、水浸出物、咖啡碱含量有升有降或变化不明显[32]。张云娟等[15]采用毛霉发酵辣木叶粉的过程中，其所含有的可溶性蛋白、可溶性多糖、多酚与游离氨基酸均发生了明显变化。辣木叶茶微生物渥堆发酵的机理尚有待进一步研究，推测是在微生物分泌的酶类及湿热作用下，其所含有的特征化学物质发生了一系列复杂剧烈的生物转化反应，从而形成了辣木叶发酵茶汤色红褐明亮与滋味醇和、回甘的品质特征。

2.4 辣木叶茶不同发酵阶段样化学成分及总色差的相关性研究

2.4.1 辣木叶茶不同发酵阶段样化学成分及总色差的相关性分析 由表3 可知，辣木叶茶不同发酵阶段样的水浸出物含量与多酚、黄酮和多糖的含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数分别为0.8821、0.7598 与0.7240。总色差△E*的大小体现的是茶色素的含量，与可溶性蛋白含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.6885，与咖啡碱含量呈显著正相关（P<0.05），相关系数为0.5825，与多酚、黄酮含量呈极显著负相关（P<0.01），相关系数分别为−0.5160 与−0.7928。多糖含量与多酚、黄酮含量呈显著正相关（P<0.05），相关系数分别为0.6017 与0.4957。可溶性蛋白含量与黄酮含量呈极显著负相关（P<0.01），相关系数为−0.6489。黄酮含量与多酚含量呈极显著正相关（P<0.01），相关系数为0.8716。

表3 各项指标的相关系数及其显著性检验结果Table 3 Correlation coefficients of indexes and significant test results

2.4.2 辣木叶茶不同发酵阶段样水浸出物与化学成分及总色差多元回归分析 茶或代用茶的水浸出物含量是评价茶品质的综合性指标，一般来说水浸出物含量越高，品质越好[33]。为找出影响辣木叶茶不同发酵阶段样水浸出物含量变化的主要因素，以水浸出物含量（Y）为因变量，辣木多酚（X1）、黄酮（X2）、可溶性蛋白（X3）、多糖（X4）、咖啡碱（X5）含量及总色差△E*（X6）为自变量进行逐步回归分析，建立多元线性回归方程，结果见表4、表5。

表4 模型方差分析结果Table 4 Results of model variance analysis

表5 多元回归分析结果Table 5 Results of multiple regression analysis

由表4 可知，通过方差分析，该模型的F值=31.43，P<0.0001，决定系数R2为0.9419，说明其有统计学意义，效果理想。由表5 可知，辣木叶茶不同发酵阶段样的水浸出物含量与辣木多酚、黄酮、可溶性蛋白、多糖、咖啡碱含量及总色差之间的线性关系经逐步回归分析后，辣木黄酮、咖啡碱及总色差△E*变量均被剔除，辣木多酚变量对水浸出物的回归达到极显著水平（P<0.01），可溶性蛋白、多糖变量达到显著性水平（P<0.05），而被引入回归方程。辣木多酚、可溶性蛋白与多糖这三个指标的标准回归系数分别0.8153、0.2524 与0.3018，表明其对水浸出物含量作用的大小顺序依次为多酚>多糖>可溶性蛋白。得到的回归方程为：Y=15.8337+0.6793X1+0.2360X3+0.0897X4，其可以把辣木叶发酵茶加工过程中水浸出物含量与多酚、可溶性蛋白、多糖含量之间的关系量化，为辣木叶茶发酵过程中的品质控制提供理论参考。

3 结论

在不同的发酵阶段，自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵4 种方式辣木叶茶不同阶段样的化学成分与品质发生了明显的变化，其评估茶汤色泽指标的L*值总体随翻堆次数的增加而下降，△E*值、a*值、b*值指标随翻堆次数的增加而有所上升，其中黑曲霉发酵各指标值变化最大；茶样色泽、净度与茶汤汤色、香气、滋味、叶底感官指标的总得分呈上升趋势，其中黑曲霉发酵总得分最高，效果最好；化学成分中的可溶性蛋白、咖啡碱含量有所增加，多酚、黄酮、多糖、水浸出物含量有所下降。辣木叶茶不同发酵阶段样的水浸出物含量与多酚、可溶性蛋白与多糖的含量呈极显著正相关（P<0.01）。本研究结果可为辣木叶茶发酵过程中的化学成分变化与品质控制提供一定理论参考，且实验表明发酵所形成的红褐色素类物质是辣木叶发酵茶的特征物质与呈色成分，但其具体的化学组成尚不清楚，下一步可对其进行系统分离纯化，研究其具体色素成分、测定方法与功能活性，为辣木叶这一资源的深度开发提供一定的技术依据。