超声波辅助双水相提取枇杷花总黄酮工艺优化及其抗氧化性

杨子敬，饶桂维, ，王 磊

（1.浙江树人大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310015；2.杭州师范大学钱江学院理工分院，浙江杭州 310015）

枇杷（EriobotryaLindl.）为蔷薇科苹果亚科常绿小乔木[1]，是一种具有药用价值的小型果树，2014 年批准成为新食品原料，药食兼用[2]。近年来，枇杷花的价值越来越受到人们重视，对其研究不断深入，枇杷花中主要成分为三萜类、黄酮类和挥发油等[3]，这些成分具有止咳、化痰、抗炎、降血糖、抗氧化、抗肿瘤[4−10]等药理作用，但是在商业种植中，果农们通过疏花来提高枇杷果的品质与价值[10−11]，导致大量枇杷花被浪费[12]。本文将对枇杷花中的黄酮类物质的提取工艺进行研究并优化，目的是更好地开发利用枇杷花资源，为枇杷花后期的研究提供一定的理论基础。

目前，枇杷花总黄酮的提取方法主要有水提法[13]、超声波辅助法[14]、酶解结合超声波法[15−16]，但提取液杂质过多、耗能较大无法实现工业化生产。大孔树脂吸附[17]也有用于提取枇杷花总黄酮，但是此方法有机残留物高、预处理难度大。双水相是一种新兴技术，它结合了从天然资源中分离、浓缩和部分纯化目标化合物的功能[18]，被广泛应用于黄酮的提取与分离[19]。张敏娜等[20]通过比较得出采用双水相提取法提取月季花总黄酮的提取率更高，方法更加简便。

本实验以枇杷花为原料，对双水相体系进行筛选，使用PEG400/硫酸铵双水相体系分离枇杷花中的黄酮，在单因素的实验结果的基础上，通过Box-Behnken 响应面法确定最佳提取工艺，为工业上快速高效提取枇杷花总黄酮提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枇杷花 来自电商购买；芦丁 上海绿源生物科技有限公司；实验所用试剂 均为国产分析纯；水超纯水。

DGG-9140A 型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司；FW80 高速万能粉碎机 天津泰斯特仪器有限公司；ME204E 电子分析天平 梅特勒托利多仪器有限公司；GL-20G-Ⅱ台式高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；L6S 紫外可见光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将枇杷花去除枝干，烘干，粉碎过200 目筛后放入保鲜袋，于干燥皿中保存。

1.2.2 标准溶液的制备与标准曲线的绘制 总黄酮的测定以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法[21]，以芦丁浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得到芦丁浓度ρ 和吸光度值A的标准曲线线性回归方程为A=0.0088ρ−0.0091，决定系数R2=0.9996，说明在2.065～103.250 mg/L 范围内，溶液浓度与吸光度值呈良好的线性关系。

1.2.3 构建双水相体系 参考文献[22−27]的双水相体系组成，分别配制24%乙醇/18%硫酸铵，41.8%乙醇/22%磷酸氢二钾，40%乙腈/25%磷酸氢二钾，31%丙酮/23%硫酸铵，70%丙酮/24%磷酸氢二钾，26% PEG400/20%硫酸铵的双水相体系。

1.2.4 枇杷花总黄酮提取 固定体系质量为10 g，在15 mL 离心管中构建不同的双水相体系，加入质量分数为0.5%的枇杷花粉末，加入超纯水直至体系质量为10 g，将离心管置于超声清洗器中超声，固定时间为40 min，功率200 W，然后用离心机将其离心，7000 r/min 离心10 min 后取出，静置直至上下相体积不再变化，记录上相体积并移取0.2 mL，按照

1.2.2 的方法将其处理并测量其吸光度，再根据线性方程计算总黄酮浓度。

1.2.5 单因素实验 分别考察超声时间、枇杷花、PEG400 和硫酸铵的质量分数对总黄酮得率的影响。

1.2.5.1 超声时间对总黄酮得率的影响 固定体系质量为10 g，在离心管中加入质量分数为0.5%的枇杷花粉，加入质量分数为26%的PEG400，加入质量分数为20%的硫酸铵，剩余质量由蒸馏水补充，再对其进行超声，时间分别为20、30、40、50、60 min。考察不同的超声时间对总黄酮得率的影响。

1.2.5.2 枇杷花质量分数对总黄酮得率的影响 固定超声时间为上述实验的最优值，其他条件不变，分别加入质量分数为0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的枇杷花粉，考察不同质量分数的枇杷花对总黄酮得率的影响。

1.2.5.3 PEG400 质量分数对总黄酮得率的影响 固定超声时间、枇杷花质量分数为上述实验的最优值，其他条件不变，分别加入质量分数为24%、26%、28%、30%、32%的PEG400，考察不同质量分数的PEG400 对总黄酮得率的影响。

1.2.5.4 硫酸铵质量分数对总黄酮得率的影响 固定超声时间、枇杷花质量分数、PEG400 质量分数为上述实验最优值，分别加入质量分数为14%、16%、18%、20%、22%的硫酸铵，考察不同质量分数的硫酸铵对总黄酮得率的影响。

1.2.6 响应面试验优化试验设计 根据单因素实验结果，选取影响总黄酮得率较大的超声时间，枇杷花、PEG400 和硫酸铵质量分数作为自变量，以总黄酮得率为响应值，利用软件Design-Expert 11 中Box-Behnken 试验原理，设计4 因素3 水平的优化试验。响应面试验因素水平表如表1 所示。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.7 枇杷花总黄酮提取及得率计算 按照1.2.4的方法提取黄酮，取少量离心后的总黄酮提取液，按

1.2.2 的方法处理并测量粗提液的黄酮浓度，再按照下式计算枇杷花总黄酮得率。

式中：c：表示根据吸光度计算出的溶液质量浓度，mg/L；D：表示稀释倍数；V：表示上相溶液体积，mL；m：表示枇杷花粉加入的质量，mg；10−3表示单位转换。

1.2.8 枇杷花总黄酮抗氧化性研究

1.2.8.1 抗过氧化氢损伤的测定 在总黄酮提取液中分别加入0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的过氧化氢，待体系稳定后，测定其吸光度[28]。

1.2.8.2 羟基自由基清除率的测定 结合文献[29]的方法，测定枇杷花总黄酮提取液对羟自由基的清除率。配制枇杷花总黄酮浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，取1.5 mL 样品溶液,分别加入1.0 mL 2.5 mmol/L的水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液和2.0 mL 蒸馏水，充分混匀，加入1.0 mL 5 mmol/L的H2O2，置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min，再置于510 nm 波长处测定其吸光度,以蒸馏水作空白参比，同时以VC作阳性对照。再按照下式计算羟自由基清除率。

式中：A0为空白对照吸光度；A2为样品溶液吸光度(加H2O2)；A1为样品溶液吸光度(不加H2O2)。

1.2.8.3 还原力的测定 还原力的测定采用普鲁士兰法并参照Oyaizu 等[30]的方法，配制枇杷花总黄酮浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，取1.0 mL溶液加入试管，加入0.2 mol/mL、pH 为6.6的磷酸盐缓冲溶液1.0 mL 和0.3%铁氰化钾溶液2.0 mL，置于50 ℃水浴条件下反应20 min，再加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，于7000 r/min 条件下离心10 min，取上清液3.0 mL，加入0.3%三氯化铁溶液0.5 mL，摇匀静置10 min，定容至10 mL。以蒸馏水代替三氯化铁，在相同条件下配制空白溶液，于700 nm 处测定吸光度,每个浓度平行做3 次，以蒸馏水作为参比。根据下式计算枇杷花总黄酮还原力。

还原力=A0−A1

式中：A0：样品吸光度；A1：空白溶液吸光度。

1.3 数据处理

利用Design-Expert 11 进行响应面分析，利用SPSS 24 统计软件、Microsoft Excel 2016 进行数据方差显著性处理和分析，所有实验均重复三次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 双水相体系的选择

不同双水相体系对枇杷花总黄酮的得率结果如图1 所示。

由图1 可知，PEG400/硫酸铵体系的得率高于其他体系提取枇杷花中总黄酮的得率，得出采用PEG400/硫酸铵体系提取枇杷花总黄酮的效果最佳，故本实验采用PEG400/硫酸铵体系。

图1 双水相体系的选择Fig.1 Choice of two-phase system

2.2 单因素实验

2.2.1 超声时间对总黄酮得率的影响 由图2 可知，随着超声时间的增加，枇杷花总黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，在超声时间为40 min 时，得率达到最大值，为22.62%。超声时间越长，细胞破碎的越完全，但继续延长超声时间时，超声波使某些黄酮类成分发生氧化、降解或缩合等反应而被破坏,使含量有所下降[31]，因此选择超声时间为40 min 为宜。

图2 超声时间对得率的影响Fig.2 Effect of ultrasound time on extraction rate

2.2.2 枇杷花质量分数对总黄酮得率的影响 由图3可知，随着枇杷花质量分数的增大，枇杷花总黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，在枇杷花质量分数为0.2%时，得率达到最大值，为25.39%。这主要是因为当上相尚未饱和时，增加枇杷花的量，得率增加，当继续加入枇杷花时，大量枇杷花导致枇杷花总黄酮提取不完全，得率下降。综合考虑成本和提取率这两方面因素，故选择枇杷花质量分数为0.2%。

图3 枇杷花质量分数对得率的影响Fig.3 Effect of loquat flower mass fraction on extraction rate

2.2.3 PEG400 质量分数对总黄酮得率的影响 由图4 可知，随着PEG400 质量分数增大，枇杷花总黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，在PEG400 质量分数为28%时，得率达到最大值，为25.70%。主要是由于上相中PEG400 质量分数增加，上相水合能力增强，使得上相体积增大，疏水性增加，利于疏水性的枇杷花总黄酮在上相中富集，当继续增加PEG400 质量分数时，双水相体系粘度增大，上相溶液的空间位阻增加，不利于黄酮的富集[27,32]，使得率减少。因此，PEG400 质量分数为28%适宜。

图4 PEG400 质量分数对得率的影响Fig.4 Effect of PEG400 mass fraction on extraction rate

2.2.4 硫酸铵质量分数对总黄酮得率的影响 由图5可知，随着硫酸铵质量分数增大，枇杷花总黄酮得率呈现先上升后下降的趋势，在硫酸铵质量分数为18%时，得率达到最大值，为26.45%。这主要是因为随着硫酸铵的增加，双水相的析出作用增强，使总黄酮更多的富集在有机相[33]，所以总黄酮得率增加，当继续增大硫酸铵质量分数时，双水相体系极性增加，使得枇杷花总黄酮主要存在于下相，造成枇杷花总黄酮得率下降，不利于黄酮的提取，因此，选择硫酸铵质量分数18%为适宜的条件。

图5 硫酸铵质量分数对得率的影响Fig.5 Effect of (NH4)2SO4 mass fraction on extraction rate

2.3 响应面试验结果

2.3.1 响应面试验设计方案及结果分析 采用Box-Behnken 响应面法对双水相萃取枇杷花中的总黄酮的超声时间，枇杷花质量分数，PEG400 质量分数和硫酸铵质量分数优化的结果如表2 所示。

表2 响应面试验结果Table 2 Results of response surface experiment

采用 Design-Expert 11 对枇杷花总黄酮得率进行数据分析得到各因素的回归拟合方程如下：Y=26.03+2.68A+0.1892B+0.0242C+0.5742D−0.5AB+0.195AC−0.4675AD+0.5325BC−0.205BD+0.075CD−3.15A2−2.85B2−1.27C2−0.9388D2

经Design-Expert11 软件ANOVA 法分析响应面二次多项式模型的显著性，实验方差结果分析如表3 所示，由表3 可知，模型中的A、D、AB、BC、A2、B2、C2、D2对枇杷花总黄酮得率的影响差异显著（P<0.05），B、C、AD、AC、BD、CD 对枇杷花总黄酮得率的影响差异不显著（P>0.05）。回归模型属于显著水平（P<0.05），失拟项差异不显著（P=0.2458>0.05），试验决定系数R2=0.9863 和校正测定系数R2adj=0.9726,低变异系数CV=1.93%。以上结果均表明模型拟合程度高，可靠性强，观察值和实测值之间的相关性良好，可以对双水相提取枇杷花中总黄酮的结果进行分析和预测。根据回归方程和方差分析可知，各因素对枇杷花总黄酮得率的影响程度由大到小依次为A>D>B>C，即超声时间>硫酸铵质量分数>枇杷花质量分数>PEG400 质量分数。

表3 响应面实验结果及方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface experiment results

响应面法是通过分析自变量之间的相互作用以及自变量对响应值影响优化工艺的方法，是一种用于食品加工中高产和产品质量验收的技术[34]。超声时间、枇杷花质量分数、PEG400 质量分数、硫酸铵质量分数之间相互作用的响应面曲线图如图6 所示。通过响应面图可直观的看出各因素之间相互影响的显著性，曲面越陡峭，说明影响越显著[35]。由图6 可以看出AC、AD、BD 和CD 之间的相互作用对得率的影响不大，响应面图较为缓和；AB 和BC的相互作用对得率的影响大，响应面图有不同程度的陡峭。

图6 各因素对响应值影响的曲面图Fig.6 Surface plot of the influence of various factors on the response value

2.3.2 最佳工艺条件的预测及验证实验 根据响应面模型预测双水相提取枇杷花中总黄酮的实验条件为：超声时间为44.125 min，枇杷花质量分数为0.199%，PEG400 质量分数为28.092%，硫酸铵质量分数为18.412%，理论总黄酮得率为26.641%，为了验证预测值的准确性，同时兼顾操作的方便性，将最佳工艺条件调整为：超声时间为45 min，枇杷花质量分数为0.2%，PEG400 质量分数为28%，硫酸铵质量分数为18%，在此工艺条件下进行验证实验，重复实验3 次，得到枇杷花总黄酮平均得率为26.96%，预测值与实验值无显著性差异，表明该模型适用于枇杷花总黄酮的提取。

2.4 枇杷花总黄酮的抗氧化性

2.4.1 抗过氧化氢损伤 如图7 所示，随着过氧化氢浓度的提高，总黄酮提取液的吸光度变化不大，说明枇杷花总黄酮对不同浓度过氧化氢的损伤具有良好的耐受力，体现了该黄酮有较强的抗氧化性。

图7 不同浓度过氧化氢对黄酮提取液的影响Fig.7 The effect of different concentrations of hydrogen peroxide on flavonoid extract

2.4.2 羟自由基清除率 枇杷花提取液对羟自由基的清除能力如图8 所示，随着提取液浓度增大羟自由基的清除率增大。在浓度0.1～0.3 mg/mL 时，总黄酮提取液对羟自由基的清除率大于Vc，在浓度达到0.5 mg/mL 时，总黄酮提取液对羟自由基的清除率达到71.89%，Vc 在相同浓度下的清除率为76.34%。总黄酮浓度在0.4 mg/mL 和0.5 mg/mL 之间不存在显著差异（P>0.05）,说明提高总黄酮浓度，清除率无明显差异。总黄酮提取液清除·OH的IC50为0.297 mg/mL，Vc 清除·OH的IC50为0.315 mg/mL。通过比较两者的IC50值，可知枇杷花总黄酮清除·OH的能力优于Vc。

图8 枇杷花总黄酮和Vc的羟自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of hydroxyl free radicals of loquat flower flavonoids and Vc

2.4.3 还原力 测定其吸光度的大小反映样品还原能力的大小，吸光度越大则还原力越强。枇杷花总黄酮和Vc的还原力测定结果如图9 所示，随着浓度的增高，枇杷花总黄酮和Vc的还原力也在增大，Vc 增加的速度高于枇杷花总黄酮，浓度越大，Vc的还原力越优于枇杷花总黄酮的还原力。

图9 枇杷花总黄酮和Vc的还原力Fig.9 The reducing power of loquat flower flavonoids and Vc

3 讨论与结论

本文研究了不同双水相体系对枇杷花总黄酮得率的影响，确定采用PEG400/硫酸铵体系来提取枇杷花总黄酮，对其提取工艺流程进行优化，最佳的工艺条件为：超声时间为45 min，枇杷花质量分数为0.2%，PEG400 质量分数为28%，硫酸铵质量分数为18%，在此条件下提取得到枇杷花总黄酮的含量为269.6 mg/g。与黄琼[14]、谢田伟[21]、郑美瑜[36]采用的提取工艺所得到的含量相比，采用双水相提取得到枇杷花总黄酮的含量更高。对采用此工艺得到的枇杷花总黄酮进行抗氧化性实验，结果表明：此工艺得到的枇杷花总黄酮具有良好的抗氧化性。黄酮类化合物既可以作为食品添加剂延缓食物的氧化，也可以预防自由基引发的多种疾病，因此枇杷花在食品和医药的研制方面都有良好的应用前景。

利用双水相提取黄酮，该方法具有操作简便、条件温和、设备简单、成本低、效率高等优点，但本实验中提取的黄酮存在于有机相中，下一步可对总黄酮提取液进行分离纯化并对成分进行分析，更加深入研究枇杷花总黄酮的抗氧化功效。本实验为枇杷花的深度利用提供了新的参考方法，但是如何将此工艺应用于工业化生产，提高枇杷花产业链的综合效益是一个新的研究方向。