EtOH/K2HPO4双水相体系萃取分离绞股蓝中的总黄酮

张亦琳，张 琴，王 吾，鄢 强，王银银

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

0 引言

绞股蓝为葫芦科植物的全草，主要分布在亚洲国家，具有清热排毒的功效，对于治疗病毒性肝炎、慢性支气管炎、体虚乏力等症在临床上有确切的疗效[1,2]，被"星火计划"列为需开发的"名贵药材"首位。2002年，绞股蓝被列入保健产品清单，可以制成保健茶等功能性食品[3]。

绞股蓝采用乙醇提取效果最好，得到粗提物，无法确定具体活性成分，但是药效得到广泛认可，药理作用主要体现在皂苷、黄酮和多糖等成分中[4]。研究发现，绞股蓝中含有大量皂苷，含量约为人参的3倍[5, 6]，总黄酮含量约为3%～5%[7]，主要有商陆素、芦丁、槲皮素及芸香苷等十余种[8]。近年兴起的微波萃取技术[9]能有效分离绞股蓝总黄酮和总皂苷，但是对设备要求较高，不利于工业化生产。因此开发条件温和、成相稳定、用时较短的双水相萃取技术对拓展绞股蓝的应用领域和工业化生产有重要意义。

双水相萃取技术的原理是被分离物在两相中的溶解特性不同，实现兼具分离和纯化双重功能的技术[10,11]，而且亲水性两相体系可提供良好的生物环境[12]，实现药用植物活性成分的分离纯化。笔者采用EtOH/NaCl、EtOH/Na2CO3、EtOH/KBrO3、EtOH/K2HPO4和EtOH/(NH4)2SO45种双水相体系，用于分离绞股蓝中的总黄酮和总皂苷，运用相平衡原理分析不同双水相体系中总黄酮的分配特征，确定最佳双水相萃取体系，实现绞股蓝总黄酮和总皂苷的有效分离，为绞股蓝的提取分离开拓新的思路。

1 材料

UV1780型紫外-可见分光光度计(日本岛津有限公司)

绞股蓝购自北京同仁堂西安大药房、人参皂苷Rb1标准品和芦丁标准品购自南京道斯夫生物科技有限公司；KBrO3、(NH4)2SO4购自成都西亚试剂有限公司；NaCl、Na2CO3、K2HPO4购自西安顺达化学试剂仪器公司。

2 方法

2.1 乙醇/无机盐双水相体系成相

在常温常压下，以EtOH为有机相，NaCl、KBrO3、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2HPO4五种盐作为试验用无机盐，通过浊点滴定法分别绘制EtOH与上述盐在水中的相图[13]。将无机盐(ms)溶于水(mw)，滴加EtOH后振荡混合至出现浑浊，记录消耗EtOH质量(mei)和溶液总质量(mi)；然后继续加入去离子水(mwj)至澄清，此时体系的总质量为mj；再滴加无水EtOH，振荡混合至浑浊，如此反复操作，并绘制相图。

EtOH质量浓度：ωei=∑mei/mi(i=1，2，3，…，n)盐的质量浓度：ωs=∑ms/mj(j=1，2，3，…，n)

2.2 乙醇/无机盐双水相体系的选择

向EtOH和无机盐体系中加入提取液，混匀后离心，测定样品各相的吸光度值，代入标准曲线求得绞股蓝总黄酮的浓度，考察相比(R)、分配系数(K)和萃取率(Y)。相比计算公式R = Vt/Vb，其中，Vt、Vb分别是上、下相体积(mL)；分配系数(K)的计算公式为K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分别是上下相提取液的质量浓度(g/L)；萃取率(收率)计算公式Y=RK/(1+RK)。

2.3 供试液的准备

在EtOH浓度80%，提取温度60℃，料液比1∶10，提取时间为120 min条件下(通过响应面试验设计法确定的提取参数)提取绞股蓝(5 g)，得到提取液总黄酮的含量：0.3713 mg·mL-1，总皂苷的含量：2.6123 mg·mL-1。

2.4 分析方法

总黄酮分析波长的确定：在200～600 nm区间内，通过紫外分光光度计对芦丁标准液和双水相体系供试液的各相进行扫描，最大吸收峰为510 nm。

总皂苷分析波长的确定：在200～600 nm区间内，加入显色剂香草醛-高氯酸-冰醋酸对人参皂苷标准液和双水相的各相进行预处理后，紫外分光光度计进行扫描，最大吸收峰为550 nm。

3 结果

3.1 乙醇/无机盐双水相体系分相能力

常温下，调整无机盐的质量分数，通过浊点法绘制各体系相图。实验证明：NaCl无法与EtOH形成双水相；(NH4)2SO4容易沉淀，形成的体系缺乏稳定性；而KBrO3、Na2CO3、K2HPO4则可与EtOH形成较为稳定的双水相体系，结果如图1所示。EtOH/Na2CO3、EtOH/K2HPO4、EtOH/KBrO33种双水相体系中，Na2CO3的相分离范围稍窄；KBrO3虽能稳定分相，但萃取分离能力较差；K2HPO4在EtOH中相分离范围广，萃取能力强。因此选择EtOH/K2HPO4系统用于提取分离绞股蓝总黄酮的双水相体系。

3.2 EtOH/K2HPO4双水相体系分离纯化绞股蓝总黄酮的最佳参数

3.2.1 乙醇和水的体积比对EtOH/K2HPO4双水相体系的影响 当加入固定量的EtOH和水时，K2HPO4的加入量越多，下相体积越大，最后达到饱和；当加入固定量的EtOH和K2HPO4时，如加入水过多，则体系不能维持双水相状态，如加入水太少，K2HPO4不能完全溶解；当加入恒定量的K2HPO4和水时，EtOH加入量过多会导致K2HPO4沉淀，EtOH加入量过少会导致不能形成双水相。结合图1，最终对水与EtOH的体积比为5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7做进一步研究。

3.2.2 磷酸盐含量对EtOH/K2HPO4双水相体系的影响 在水和EtOH体积比分别为5∶5、4∶6、3 ∶7的条件下，改变K2HPO4的添加量，并测定萃取后上下相的吸光度，结果如图2所示。

从图2可以看出，当EtOH或K2HPO4的含量增大时，上相绞股蓝总黄酮的含量会减小。当K2HPO4的加入量恒定时，下相溶液的体积随着EtOH浓度增高而减小，提高了K2HPO4的浓度，溶液碱性增大，总黄酮的溶解度增加；当EtOH加入量恒定时，随着K2HPO4加入增多，上相EtOH浓度增加，总黄酮的浓度也增加。在形成过程中，EtOH和K2HPO4在双水相体系中竞争水分子，K2HPO4与水更易结合，从而降低了上相溶液中总黄酮的含量。实验表明，V水∶VEtOH=3 ∶7时，体系的分配系数和萃取率最高，且随K2HPO4加入量增加，相比减小，分配系数增加，萃取率变化较小，因此，选用V水∶VEtOH=3 ∶7，K2HPO4的加入量为2.0 g为双水相萃取体系的最佳体系。该体系EtOH的质量分数为52.49%，K2HPO4的质量分数为19.01%，此时相比R为2.84，分配系数K为19.87，总黄酮的萃取率Y为98.26% 。

3.2.3 EtOH/K2HPO4双水相体系萃取绞股蓝总黄酮的应用 将制备好的绞股蓝供试液加入到最佳双水相体系中，混合均匀，上下相分配完全后，离心分相，测定供试液的吸光度，结果如图3所示。萃取前，绞股蓝供试液中总黄酮含量为2.1992 g·mL-1，体积为5.4 mL；萃取后上相浓度为6.1294 g·mL-1，体积为6.7 mL；下相浓度为0.5609 g·mL-1，体积为1.3 mL。由此可知，绞股蓝总黄酮主要富集在EtOH/K2HPO4双水相体系的上相中，纯度较高。

绞股蓝提取液不仅含有丰富的黄酮类化合物，还有较多的皂苷，因此我们进一步测定了在最佳EtOH/K2HPO4双水相体系下绞股蓝皂苷在上下相中的分配情况，结果如图4所示。实验表明，用双水相体系萃取后，绞股蓝皂苷主要富集在下相，而黄酮主要富集在上相，从而在一定程度上实现了纯化绞股蓝黄酮的目的。

3 结论

绞股蓝因其藤蔓较多，提取前需要完全粉碎，以增加有效成分的溶解。黄酮是绞股蓝中含量较多的物质之一，大部分能溶于乙醇，因此双水相试验中使用EtOH作为溶剂，而且EtOH具有较大的水化能，很少有无机盐能与其形成双水相，且相比R难趋近于1[14]。K2HPO4在EtOH/H2O溶液中，有相当宽的相分离区间和较高的K，同时，K2HPO4是弱碱盐，能够使体系得pH保持在弱碱性环境中，确保了黄酮在体系中的完全溶解，并且也不会因碱性过高而使黄酮失活。本研究最后确定的最佳EtOH/K2HPO4体系为：EtOH的体积分数为52.49%，K2HPO4的质量分数为19.01%，此时K为19.87，R为2.84，总黄酮的萃取率为98.26%。绞股蓝总黄酮在EtOH上相富集，而易溶于水的皂苷等水溶性成分主要富集在下相，此萃取技术实现了黄酮与皂苷化合物的提取分离，在绞股蓝活性物质的分离方面有较大应用前景。