可口革囊星虫体腔液多糖碱提工艺优化及其抗氧化性研究

陆伊俏，池海波, ，厉桂宁，陈 纤，邱家港，余 辉，方旭波，陈小娥

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316000；2.浙江国际海运职业技术学院，浙江舟山 316000）

可口革囊星虫（Phasolosma esculenta），属于星虫动物门（Sipuncula），革囊星虫纲（Pha-scolosomatidea），革囊星虫目（Phascoloso-maliformes），革囊星虫科（Phascolosomati-dae），俗称海泥虫、海丁、土笋等，是一种重要的海洋经济无脊椎动物，广泛分布于我国东南沿海广东、海南岛、福建和浙江等地[1−2]，具有滋阴、补肾、去火的食疗作用，被誉为“动物人参”、“海冬虫夏草”。在福建，可口革囊星虫体壁为特色传统风味小吃—“土笋冻”的原材料，味美甘鲜，深受消费者喜爱。但是，作为加工副产物的星虫体腔液，长期以来一直被随意废弃，未得到合理利用。

研究表明，星虫含有丰富的蛋白质、微量元素等多种活性物质，具有延缓衰老、抗氧化、抗疲劳、耐缺氧等功效[3−7]，如沈先荣等[8]报道方格星虫提取物能显著延长果蝇的寿命，具有明显延缓衰老的作用；郑志鸿等[9]发现方格星虫酶解物可缩短止血时间，增进胶原蛋白沉积，具有促进伤口愈合的功效。Yang 等[10]发现从可口革囊星虫体壁提取的酶解寡糖具有抗炎和抗氧化功效，可提高大肠杆菌诱导的败血症小鼠的抵抗能力。实验测得可口革囊星虫体壁、内脏、体腔液分别约占原料湿重的25%、15%、60%，目前对其体壁研究较多，而关于可口革囊星虫体腔液中的多糖活性成分则鲜有报道，尚待深入研究。可口革囊星虫多糖的提取方法主要有碱浸提法和酶解法等，刘玉明等[11]研究发现碱法提取工艺得率最高，优于酶解法，且碱浸提法对设备要求低、方法简便，方案成熟，能够准确、快速及稳定提取多糖。同时，碱性溶液有利于酸性多糖在提取中快速析出，不但可以提高多糖得率，而且可以缩短提取时间[12]。本文从提高海洋资源综合利用价值、开发新型海洋生物功能物质角度出发，以可口革囊星虫加工过程的副产物——体腔液为原料，提取其中的活性多糖，采用正交试验优化碱提可口革囊星虫体腔液多糖工艺参数，以总还原力、DPPH 清除率以及羟基（·OH）自由基清除率这三个抗氧化性检测指标，对多糖成分进行抗氧化性评价，用高效液相色谱法测定多糖的单糖组成，并利用红外光谱对多糖成分进行初步分析，为可口革囊星虫体腔液活性多糖的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

可口革囊星虫 福建夏蒲星虫养殖户；十二烷基硫酸钠（SDS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；铁氰化钾、L(+)-抗坏血酸、水杨酸等试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

SM800 酶标仪 上海永创生物工程有限公司；5804R 台式高速冷冻离心机 德国艾本德股份公司；LGJ-10C 冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；iCAN 9 傅里叶红外光谱仪 天津市能谱科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 可口革囊星虫体腔液营养成分分析 水分的测定参照GB5009.3-2016 直接干燥法[13]；粗蛋白质的测定参照GB5009.5-2016 凯氏定氮法[14]；粗脂肪的测定参照GB5009.6-2016 索氏抽提法[15]；灰分的测定参照GB5009.4-2016—550 ℃灼烧法[16]。

1.2.2 可口革囊星虫体腔液多糖的提取

1.2.2.1 碱浸提法提取多糖 将可口革囊星虫解剖分为体壁、体腔液、内脏三部分。体腔液用组织匀浆机进行匀浆，加入一定质量浓度的氢氧化钠溶液，恒温水浴浸提一定时间，酸中和后过滤，滤渣反复浸提多次，合并滤液。上清液加乙醇至终浓度为70%，4 ℃沉淀过夜后于9000 r/min、4 ℃条件下冷冻离心，沉淀即为可口革囊星虫体腔液多糖[17−18]。将所得沉淀干燥并进行称量并计算粗多糖得率，保存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2.2 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定体腔液多糖中总糖含量[19−20]。以葡萄糖为对照品，分别吸取葡萄糖标准溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL，用蒸馏水补充至2 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，混匀，迅速加5.0 mL 浓硫酸，室温放置30 min，于490 nm 处测定吸光度，以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线（y=2.7657x+0.0234，决定系数R2=0.995）。取同浓度可口革囊星虫体腔液多糖样品，按照上述方法测定吸光度，代入标准曲线回归方程，得到该浓度粗多糖中对应的总糖含量。根据下式计算单位质量星虫多糖所含总糖含量：

1.2.2.3 正交试验 在前期单因素实验基础上，以多糖得率为考察指标，选择提取温度（A），碱提时间（B）和NaOH 质量浓度（C）3 个因素进行L9（34）正交试验。试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.3 可口革囊星虫多糖体外抗氧化活性分析

1.2.3.1 总还原力测定 向比色管中添加0.5 mL 浓度梯度（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）样品溶液，0.5 mL 95%乙醇，5 mL 水，1.5 mL 1 mol/L 盐酸，1.5 mL 铁氰化物溶液（1%），0.5 mL 十二烷基硫酸钠（1%），最后添加0.5 mL 氯化铁（0.2%），以使最终体积为10 mL。将混合物在50 ℃水浴中培养20 min，冷却至室温，溶液的颜色稳定至少30 min，在试剂空白处测量750 nm（A750nm）时吸光度[21−22]。以相同浓度梯度Vc 作阳性对照。总还原力计算公式为：

式中，A1为样品组吸光度；A2为空白组（即不加氯化铁显色剂）的吸光度；A0为对照组（即样品换成水）吸光度。

1.2.3.2 DPPH 自由基清除活性测定 将不同浓度（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）的多糖溶液与1 mL 含有DPPH 自由基的甲醇溶液混合，得到DPPH的最终浓度为0.2 mmol/L，剧烈摇动混合物并静置30 min，在517 nm 处测定吸光度[23−24]。以相同浓度梯度Vc 作阳性对照。DPPH 清除率的计算公式为：

式中，A0为对照物的吸光度；A1为样品的吸光度。

1.2.3.3 羟基自由基（·OH）清除活性测定 反应混合物（3.0 mL）含有1.0 mL 1.5 mmol/L 硫酸亚铁、0.7 mL 6 mmol/L 过氧化氢、0.3 mL 20 mmol/L 水杨酸和不同浓度的多糖溶液（即1、5、10、15、20、25 mg/mL）。在37 ℃孵育1 h 后，在562 nm 处测定羟基水杨酸络合物的吸光度[23,25−26]。以相同浓度梯度Vc 作阳性对照。羟基水杨酸配合物的清除活性计算公式如下：

式中，A0为对照物（不含多糖）的吸光度；A1为含有多糖时的吸光度；A2为不含水杨酸钠的吸光度。

1.2.4 单糖组成测定 称取1.0 mg 可口革囊星虫体腔液多糖样品溶于0.5 mL 2 mol/L TFA（三氟乙酸）溶液中，于120 ℃水解2 h 后，置于氮吹仪下干燥，除去TFA。称取150 μL 1 mg/mL的甘露糖（Man）、葡萄糖醛酸（GlcA）、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc）标准品，得到标准品混合液，置于酸水解小瓶中备用。将样品水解产物及九种标准品于PMP（1,3,5-吡唑酮）中70 ℃水浴锅进行柱前衍生化反应30 min，将衍生化的溶液进行HPLC 检测。HPLC 分析方法：采用Agilent 1260 Infinity HPLC 系统，Thermo ODS-2 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 mm），柱温25 ℃，流速为1.0 mL/min[27]。

1.2.5 红外光谱分析 称取星虫体腔液多糖约0.0010 g，在红外灯下用KBr 进行研磨并压片，用iCAN 9 傅里叶红外光谱仪进行分析。扫描次数为32 次，分辨率为4，扫描范围400～4000 cm−1[28−29]。

1.3 数据处理

采用SPSS 21.0 检验试验数据差异性，制图采用Origin 2019 软件，方差分析采用Duncan 法进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 可口革囊星虫体腔液营养成分分析

对可口革囊星虫的体腔液营养成分进行分析，由表2 可知，可口革囊星虫体腔液的主要成分为水，其含水量高达90.06%，徐艳等[30]研究发现方格星虫体腔液的含水量为96.69%，两者结果基本一致。可口革囊星虫体腔液除去水分后，总糖、蛋白质、矿物质和脂肪的含量分别为17.20%、60.97%、13.98%和7.85%，可知星虫体腔液是一种多糖含量较高的优质动物资源。董兰芳等[31]研究发现可口革囊星虫成虫体壁干品总糖含量为5.26%，与牛改改等[32]测得的方格星虫体壁干品总糖含量相近（5.68%）。相比于星虫体壁，可口革囊星虫体腔液干品中的总糖含量更高，因此可作为多糖提取的一种原料。

表2 可口革囊星虫体腔液基本成分表Table 2 Basic components of the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.2 可口革囊星虫体腔液多糖提取正交试验结果

可口革囊星虫体腔液多糖提取正交试验结果见表3，从表3 可知三个因素对多糖得率大小的影响程度为A（提取温度）>B（碱提时间）>C（NaOH 质量浓度）。结合表4 可知，提取温度、碱提时间以及NaOH 质量浓度对可口革囊星虫体腔液多糖的得率影响均不显著（P>0.05）。相对来说，提取温度（A）是影响星虫体腔液多糖得率的最主要因素，碱提时间和NaOH 质量浓度对星虫体腔液多糖提取影响相近，但在不同水平上星虫体腔液多糖得率均有较大差异。多糖得率越高，提取效果越好，比较K 值大小可以得知可口革囊星虫体腔液多糖得率最优组合为A1B2C2，即提取温度50 ℃、碱提时间3 h、NaOH 质量浓度1.5%。按照优化工艺进行验证性试验，平行3 次。可口革囊星虫体腔液多糖得率为0.92%，说明此方法稳定，为最佳工艺。苯酚-硫酸法测得总糖含量为75.45%。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Table 4 Results of variance analysis

2.3 可口革囊星虫体腔液多糖抗氧化性活性

2.3.1 总还原力 总还原力是评估抗氧化剂活性的一个重要指标。样品还原能力越强，吸光值就越大[33]。由图1 可知，可口革囊星虫体腔液多糖总还原力随质量浓度的增大而增强，半数清除浓度（IC50）为2.976 mg/mL，Vc的半数清除浓度（IC50）为0.048 mg/mL，相较于Vc 该多糖的总还原力较弱。当多糖质量浓度为10 mg/mL 时，总还原力大小为82.29%，高于同浓度乌贼墨多糖的总还原力（57.43%）[34]。以上结果显示，可口革囊星虫体腔液多糖具有良好的抗氧化性。

图1 可口革囊星虫体腔液多糖总还原力Fig.1 Total reducing power of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.3.2 DPPH 自由基清除活性 DPPH 是一种稳定的自由基，常用于测定天然化合物的自由基清除活性。在自由基形式下，DPPH 在517 nm 处吸收，但在使用抗氧化剂还原后，由于其非自由基形式DPPH–H的形成，其吸收减少[23]。因此，在存在供氢抗氧化剂的情况下，自由基清除活性可被监测为DPPH 溶液吸光度的降低。

图2 显示了可口革囊星虫体腔液多糖的DPPH自由基清除能力，该多糖对DPPH的清除能力随质量浓度的增加而逐渐增强，具有一定的量效关系，半数清除浓度（IC50）为0.567 mg/mL，且当质量浓度在5～10 mg/mL 时，清除率迅速升高；Vc的半数清除浓度（IC50）为0.019 mg/mL，该多糖对DPPH的清除能力弱于Vc。当质量浓度为10 mg/mL 时，体腔液多糖对DPPH 自由基清除率达到76.68%，与相同浓度的方格星虫多糖（76.31%）[35]和酶提可口革囊星虫多糖（82.22%）[36]对DPPH的清除率相近，且高于同浓度的拟目乌贼肌肉多糖（68.00%）[37]。这说明可口革囊星虫体腔液多糖是一种具有清除自由基活性的抗氧化剂，且抗氧化性较强。可推测可口革囊星虫体腔液多糖对DPPH 自由基具有供氢能力，氢与自由基结合形成稳定化合物，从而使反应终止。

图2 可口革囊星虫体腔液多糖对DPPH的清除率Fig.2 The clearance rate of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta on DPPH

2.3.3 羟基自由基（·OH）清除活性 羟基自由基在生物系统中是一种非常活跃的活性物质，在自由基病理学中被认为是高度破坏性的物种，能够破坏活细胞的生物分子[38]。由图3 可知，可口革囊星虫体腔液多糖对·OH的清除能力随质量浓度的增大而增强，呈现出浓度依赖性，其半数清除浓度（IC50）为0.605 mg/mL，较海参脏器多糖HPS1 和HPS2 高（IC50分别为0.89、0.64 mg/mL）[39]，Vc的半数清除浓度（IC50）为0.011 mg/mL。当质量浓度为10 mg/mL时，体腔液多糖对·OH的清除率达到65.97%，高于同浓度方格星虫多糖提取物（56.93%）[35]，与Vc 相比，其清除能力相对较弱，Vc 浓度为1 mg/mL 时即可达到相同清除效果。

图3 可口革囊星虫体腔液多糖对·OH的清除率Fig.3 Elimination rate of ·OH by polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.4 可口革囊星虫体腔液多糖单糖组成

以Glc、Xyl、Man、Gal、Ara、Rha、Fuc、Glc A 和Gal A 为标准单糖样品，9 种单糖标准品的色谱峰及出峰时间如图4 所示。对可口革囊星虫体腔液多糖的单糖组成高效液相色谱图（图5）分析可知，可口革囊星虫体腔液多糖的单糖组成较单一，主要为葡萄糖。已有的研究显示扇贝多糖[40]、乙酰化的星虫爱氏海葵多糖[41]、青蛤多糖[42]及近江牡蛎多糖[43]等均由单一葡萄糖构成，且均具有抗氧化性。可见由单一葡萄糖组成的多糖发挥抗氧化性是水生无脊椎动物的一种重要特征。目前尚未见关于可口革囊星虫体腔液单糖组成的报道，可口革囊星虫体壁多糖由葡萄糖、甘露糖等8 种单糖组成[36]，方格星虫体壁多糖由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成[44]，星虫体壁多糖与体腔液多糖的的单糖组成差异较大，可能与体壁和体腔液在星虫生物体的功能不同有关，其具体结构与发挥功能活性的机理有待进一步研究。

图4 混合标准单糖高效液相色谱图Fig.4 HPLC of mixed standard monosaccharides

图5 可口革囊星虫体腔液单糖组成高效液相色谱图Fig.5 HPLC of monosaccharide composition in the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

2.5 红外光谱分析体腔液多糖

由图6 可知，3420 cm−1附近吸收峰宽而强，是典型的多糖-OH 伸缩振动吸收峰；在2930 cm−1处为C-H的伸缩振动吸收峰，1650、1420 cm−1代表2 种典型的酰胺峰，前者为氢键缔合影响导致偏移的酰胺Ⅰ带，后者为N-H 键的面内弯曲振动的酰胺Ⅱ带，证明该多糖为糖蛋白缀合物。1160、1080和1020 cm−1这三个吸收峰的存在证明该多糖具有吡喃糖苷[45]。847 cm−1附近吸收峰表明多糖中α糖苷键的特征峰。此外，1020～524 cm−1之间也存在不同程度的吸收，这些峰均可作为可口革囊星虫体腔液多糖的鉴别特征峰。综上，可口革囊星虫体腔液多糖是含有乙酰氨基和吡喃环，以α糖苷键连接的多糖。这与李妍妍等[46]研究结论一致。

图6 可口革囊星虫体腔液多糖红外光谱图Fig.6 Infrared spectra of polysaccharides from the coelomic fluid of Phascoloma esculenta

3 结论

本研究采用碱浸提法从可口革囊星虫体腔液中提取活性多糖，利用正交试验得到最佳提取工艺：提取温度50 ℃、碱提时间3 h、NaOH 质量浓度1.5%，在此工艺下，体腔液多糖得率最高为0.92%。多糖在体外抗氧化活性检测中展现出良好的抗氧化作用，其总还原力的半数清除浓度（IC50）为2.976 mg/mL，对DPPH 和羟基自由基也有很好的清除作用，它们的半数清除浓度（IC50）分别为0.567、0.605 mg/mL。该多糖主要由葡萄糖组成，在傅里叶红外光谱下呈现多个多糖特征吸收峰，其含有乙酰氨基和吡喃环，以α-糖苷键连接，为典型的动物多糖。本研究提供了一种提取可口革囊星虫体腔液多糖的方法，测定所提多糖的抗氧化性及其单糖组成，为工业上更广泛开发利用可口革囊星虫体腔液多糖提供科学依据。但本研究只得到可口革囊星虫体腔液多糖的粗提物，对可口革囊星虫体腔液多糖的纯化及其结构方面的研究和相关产品的开发尚待更进一步研究。