外源添加物对鲢鱼-鳕鱼复合鱼糜凝胶性能的影响

张一鸣，李思仪，沈晓溪，石晨晖，尚宏丽

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121001）

鱼糜是以不同种类鱼肉为原料并经过清洗、采肉、漂洗、脱水等关键步骤所制备的深加工鱼肉制品，为一种优质的高蛋白食品，一直深受国内外消费者的喜爱。鱼糜制品的原料大多都是采用海水鱼，其主要原因是海水鱼中的肌原纤维蛋白含量较高，其凝胶性能显著优于淡水鱼类鱼糜[1]。但是单一海水鱼所制鱼糜，其成本较高，生产费用显著提升，因此鱼糜生产厂家一直致力于研发海水鱼和淡水鱼复合鱼糜制品，且复合鱼糜制品的凝胶性能优于单一鱼糜制品[2]。我国鲢鱼产量大，且肉薄刺多、脂肪较低并且不易保存，在市面上主要以鲜销为主。而我国海水鱼中鳕鱼，其营养丰富，在我国生产量大，因此本研究预将鲢鱼与鳕鱼复合制成鱼糜，弥补淡水鱼鱼糜的不足[3]，同时丰富鱼糜制品的多样性。

检验鱼糜品质的优劣最重要的指标就是鱼糜凝胶强度。Hongbo Mi[4]研究表明淀粉类对于鱼糜凝胶有较明显的改善，以此为基础可以尝试将不同外源添加物复配改善复合鱼糜凝胶特性。谷氨酰胺转氨酶（Glutamine transaminase,TGase）也可以有效改善蛋白质的凝胶性能，这是因为它能催化肌球蛋白上赖氨酸的ε－氨基和谷氨酸残基上的γ－酰胺基形成共价键，使蛋白质之间或蛋白质内部发生相互作用，可以用来提升鱼糜的粘弹性[5−6]。同时有研究表明，淀粉可以提高鱼糜的持水性，使鱼糜拥有良好的吸水性和黏着性；蛋清蛋白具有较好的凝胶性能，添加后还可以使鱼糜中水分、脂肪、肌肉蛋白质和淀粉等成分形成稳定均匀的系统，继而提升鱼糜制品的持水性和嫩度等[7−8]。

本研究以鲢鱼与鳕鱼为主要原料，选择外源添加物马铃薯淀粉、谷氨酰胺转氨酶（TGase）以及蛋清蛋白的添加量为单因素，以复合鱼糜凝胶强度为响应值，采用Box-Behnken 响应面优化鲢鱼与鳕鱼复合鱼糜凝胶性能，同时利用质构测定分析和扫描电镜对其外源添加物作用机理进行初步探究，旨在为开发凝胶性能较强，成本低的鲢鱼与鳕鱼复合鱼糜制品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲢鱼、鳕鱼 锦州市古塔区农贸海鲜综合市场；谷氨酰胺转氨酶（TGase） 江苏一鸣生物股份有限公司，酶活100 IU/g；蛋清蛋白 苏州欧福蛋业股份有限公司；食盐、马铃薯淀粉 锦州市超市。

QTS－25 型质构仪 美国 Brookfield 公司；FA1004 型电子天平、HH-4 型数显恒温水浴锅 上海力辰邦西仪器科技有限公司；ZB－50 型斩拌机揭东县港美吴哲食品机械厂；FW100型高速匀浆组织捣碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；80-2 型高速离心机 江苏省金坛新瑞仪器制造有限公司；KYKY-EM8000F 型扫描电镜 北京中科科仪股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合鱼糜制作过程 参考王玉凤等[9]的方法并稍作修改，将新鲜鲢鱼、鳕鱼头、尾、内脏去除后用清水清洗干净，将鱼肉和皮、骨分离并将鱼肉搅碎后在常温下漂洗（鱼肉:水的比例为1:5～1:10），鲢鱼与鳕鱼按照5:1的比例复合并加入辅料及添加剂后调节至水分含量为70%[10]，加入2.5% NaCl 擂溃成型，再利用二段式加热（40 ℃水浴加热30 min，90 ℃水浴加热20 min）成为混合鱼糜凝胶，将混合鱼糜凝胶样品冷却后在4 ℃下贮藏。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 马铃薯淀粉的添加量对鱼糜凝胶性能影响取200 g 复合鱼糜，分别添加0%、4%、8%、12%、16%的马铃薯淀粉并充分搅拌，冷却至室温后放入冷藏温度下贮藏，测定不同马铃薯淀粉添加量的鱼糜凝胶性能。

1.2.2.2 TGase的添加量对鱼糜凝胶性能影响 取200 g 复合鱼糜，分别添加0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的TGase 充分搅拌，冷却至室温后放入冷藏温度下贮藏，测定不同TGase 添加量的鱼糜凝胶性能。

1.2.2.3 蛋清蛋白添加量对鱼糜凝胶性能影响 取各200 g 复合鱼糜，分别添加1%、3%、5%、7%、9%的蛋清蛋白进行搅拌，冷却至室温后放入冷藏温度下贮藏，测定不同蛋清蛋白添加量的鱼糜凝胶性能。

1.2.3 响应面优化设计 利用Design-Expert 8.05软件，根据Box-Behnken 设计原理，以复合鱼糜凝胶强度为响应值，对复合鱼糜制备工艺参数进行优化，试验因素水平编码如表1 所示[11]。

表1 响应面试验的因素及水平设计Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.4 复合鱼糜凝胶性能的测定

1.2.4.1 复合鱼糜凝胶强度的测定 将待测试鱼糜样品切成2 cm×2 cm×2 cm的长方体块状，通过质构仪在室温状态下进行凝胶化测定。选用P35 探头,测前速率为1.00 mm/s,测中速率为1.00 mm/s,测后速率1.00 mm/s,压缩程度为30 %,并且两次压缩间隔的时间为5.00 s,触发力5.0 g,数据采集速率为400 p/s，每组测量平行4 次及以上，重复试验3 次，结果取平均值[12]。

1.2.4.2 复合鱼糜持水性测定 将待测样品切成大约3 mm 厚度的薄片并称重量（W1），先将3 张滤纸置于下方，上面再放2 张滤纸，用5 kg的重物压制并保持2 min，取出滤纸，再次称重（W2），持水性按下式计算：持 水性(%)=×100[13]

式中：W1—第一次称重的质量（g）；W2—第二次称重的质量（g）。

1.2.5 复合鱼糜质构特性对比 质构剖面分析（TPA）能够通过质构仪模拟人的口腔咀嚼动作来探讨食品的质构特性，得到与人的感官评价相关的质构特性值。将优化工艺组（马铃薯淀粉添加量16%，TGase 添加量为0.4%，蛋清蛋白添加量为6%）与普通工艺组（马铃薯淀粉添加量、TGase 添加量、蛋清蛋白添加量均为0）分别进行TPA 试验。使用质构仪测定各组样品的硬度、弹性、咀嚼性、粘结性、破断力、破断距离，各组鱼糜平行测定12 次，选用5 mm的通用柱形探头的质构仪,测试前速率1.00 mm/s,测试中速率1.00 mm/s,测试后速率1.00 mm/s,30%的压缩程度,并且两次压缩间隔的时间为5.00 s,触发力5.0 g,数据采集速率为400 p/s[14]。

1.2.6 复合鱼糜凝胶扫描电子显微镜（SEM）测定参考余永名等[15]的方法，略作修改。将鱼糜凝胶切成3 mm×3 mm×3 mm 小块，用 2.5%的戊二醛固定12 h，用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.2）漂洗3 次，每次5 min，采用不同体积分数为 30%、50%、70%、90%、95%和100%的乙醇梯度脱水，15 min/次，最后将样品放入真空冷冻干燥机中干燥8 h，离子溅射镀金，用扫描电子显微镜观察微观结构。

1.3 数据处理

数据处理选用SPSS 21.0 软件进行方差分析（ANOVA），P<0.05 为差异性显著。所有指标检测均测定三次取平均值加减标准差。

2 结果与分析

2.1 马铃薯淀粉添加量对复合鱼糜凝胶强度以及持水性的影响

凝胶强度由凝胶的硬度和弹性共同体现，即凝胶破断力和破断距离的乘积，是反应复合鱼糜凝胶性能的一个重要指标，由图1 可知，随着马铃薯淀粉添加量的增加，其复合鱼糜凝胶强度明显增强，当马铃薯添加量在8%时，其凝胶强度变化趋于平缓，此时凝胶强度为1430 g·cm，与对照组相比，凝胶强度提高了81%。增强复合鱼糜凝胶强度原因主要是马铃薯淀粉在遇到较高温度时，淀粉中的支链可以增强吸水性进而吸水膨胀从而形成凝胶，这样蛋白质凝胶的网络结构中就会填充淀粉凝胶，使复合鱼糜凝胶的结构之间变得更加紧密[16]，马铃薯淀粉添加量对凝胶强度的影响差异显著（P<0.05）。

图1 马铃薯淀粉添加量对凝胶性能的影响Fig.1 Effect of potato starch addition on gel properties

鱼糜凝胶的持水能力取决于肌球蛋白与肌动蛋白交联形成的三维网络结构，鱼糜的持水性与鱼糜的凝胶强度有一定的关系，共同反映了鱼糜凝胶微观网络结构的紧密程度，以及对水分保留能力的强弱[17]。由图1 可知，随着马铃薯淀粉的添加量逐渐增加，持水性显著性（P<0.05）增强，这与马海建等[18]的研究一致，这是因为淀粉颗粒可以遇水后膨胀，可以明显的保留住鱼糜中的水分，增强鱼糜持水性[19]。

2.2 谷氨酰胺转氨酶（TGase）添加量对复合鱼糜凝胶强度以及持水性的影响

由图2 可知，随着酶TGase 添加量的增加，复合鱼糜凝胶强度先增加后降低，在0.2%～0.4%范围之间，复合鱼糜凝胶强度增强，在添加量超过0.4%之后，复合鱼糜凝胶强度减弱，这与陈瑜等[20]研究结果一致。由于TGase 添加量的持续增多，凝胶强度反而下降，这可能是因为添加过多的TGase，会使蛋白质分子间过度交联而破坏凝胶的网状结构，TGase 作用在鱼糜中形成了过多的ε（γ-谷氨酰）赖氨酸键，会让鱼糜凝胶变的又硬又脆，TGase 会使蛋白质分子间形成ε（γ-谷氨酰）赖氨酸键共价键，而其作用强度是氢键和疏水键的20 倍[21]，TGase的添加量在0.4%时最为合适。

图2 TGase 添加量对凝胶性能的影响Fig.2 Effect of TGase on gel properties

由图2 可知，复合鱼糜持水性随着TGase 添加量的增加而增强，在TGase 添加量为0.4%时，持水性达到最高值为94%，当添加量≥0.4%时，其持水性无显著变化（P>0.05），因为加入TGase 能促进复合鱼糜反应体系中谷氨酸的γ-酰胺基团与赖氨酸的ε-氨基产生交互反应，生成异肽键使蛋白分子之间或分子内互相交联，改变蛋白质结构，对复合鱼糜持水性有利。综合而言，TGase 添加量浓度为0.4%时，复合鱼糜凝胶性能最好。

2.3 蛋清蛋白添加量对复合鱼糜凝胶强度以及持水性的影响

由图3 可知，蛋清蛋白添加量在1%～5%之间，复合鱼糜的凝胶强度呈逐步增长趋势，当添加量为5%时，凝胶强度达到了最大值为2790 g·cm，高于对照组。蛋清蛋白作为一种活性黏连剂，能够与蛋白质基质形成相互作用，通过影响破断强度来改变鱼糜的凝胶强度[22]。当添加量>5%后，凝胶强度下降，可能由于蛋清蛋白含量过高影响复合鱼糜的破断距离，破坏了复合鱼糜的凝胶，从而导致了复合鱼糜的凝胶强度变低，这与其他学者研究结果一致[23]。

图3 蛋清蛋白添加量对凝胶性能的影响Fig.3 Effect of egg white protein on gel properties

由图3 可知，当蛋清蛋白添加量<5%时，持水性随着蛋清蛋白的增加而增强，当蛋清蛋白添加量为5%时，复合鱼糜的持水性为85%，高于对照组11%，随着持水性的不断增高，复合鱼糜的保水性在增强，鱼糜的品质也会得到改善，当蛋清蛋白添加量>5%时，鱼糜持水性变化不显著（P>0.05）。综合得到，蛋清蛋白添加量在5%最合适。

2.4 响应面分析法优化复合鱼糜工艺试验结果

2.4.1 方差和回归分析 Box-Behnken 试验设计的因素水平及结果如表2 所示。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experiment design and results of response surface experiment

表2 中共有17 个测试点，包括12 个析因点和5 个零点。试验编号为1～12 为析因试验，试验编号为13～17 为中心试验。析因点代表自变量取值在X1、X2、X3三个变量所构成的三维顶点，零点代表中心水平，此测试重复5 次，以估计误差[24]。通过Design-Expert 8.05 软件对表2 中的数据进行多元回归拟合后，得到响应值（Y）与各因素（X1、X2、X3）的多元二次回归方程:

2.4.2 复合鱼糜凝胶强度的方差分析 根据 Box-Benhnken 试验原理，结合单因素实验结果，考察马铃薯淀粉（X1）、TGase（X2）及蛋清蛋白（X3）添加量对复合鱼糜凝胶强度（Y）的影响，鱼糜的品质与其凝胶强度呈正相关，因此常通过测定鱼糜的凝胶强度值来评估其鱼糜的品质[25]。方差分析结果如表3 所示。

表3 凝胶强度回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of gel strength regression model

由表3的方差分析结果可知，该试验模型方程极显著（P=0.0002<0.01），失拟项不显著（P=0.4218>0.05），说明该回归模型与实际值拟合的较好。回归方程的二次项相关系数R2=96.64%，表明大约有97%的变异存在于3 个自变量当中，仅有约3%的总变异不能用回归模型解释[26]。所以，复合鱼糜凝胶强度影响因素的真实值可以用该回归方程加以分析和预测。通过表3 中的P值，可以看出蛋清蛋白添加量的一次项，马铃薯淀粉添加量二次项和蛋清蛋白添加量的二次项均达到了极显著水平（P<0.01），但各因素之间的交互作用均不显著，图4-图6 所示的是其交互作用的响应曲面图。通过F值还可以看出，各因素对复合鱼糜凝胶强度的影响显著性次序为蛋清蛋白添加量>马铃薯淀粉添加量>TGase 添加量，说明各影响因素和响应值之间并不是普通的线性关系。

2.4.3 响应面分析 运用响应面软件，根据凝胶强度的回归方程所得响应面分析图，可更直观地反应出每个自变量之间的交互作用[27]。由图4～图6 可清楚的看到马铃薯淀粉添加量与蛋清蛋白的添加量的交互作用对于复合鱼糜的凝胶强度影响较大，因为两者交互的响应面图比较陡，而马铃薯淀粉添加量与TGase 添加量交互以及TGase 添加量与蛋清蛋白添加量交互的响应面图比较平缓，所以对复合鱼糜凝胶品质影响不大。

图4 马铃薯淀粉添加量与谷氨酰胺转氨酶添加量对鱼糜凝胶强度的三维曲面图Fig.4 Three-dimensional curve of potato starch and glutamine transaminase on gel strength of surimi gel

图5 马铃薯淀粉添加量与蛋清蛋白添加量对鱼糜凝胶强度的三维曲面图Fig.5 Three-dimensional curve of potato starch and egg white on the strength of surimi gel

图6 谷氨酰胺转氨酶添加量与蛋清蛋白添加量对鱼糜凝胶强度的三维曲面图Fig.6 Three-dimensional curve of the addition of glutamine aminotransferase and egg white protein on the strength of surimi gel

进一步用 Design-Expert 8.05 软件对回归模型进行典型性分析，根据软件得出优化结果，经优化后，为使复合鱼糜凝胶强度达到最大，各因素的最佳值为马铃薯淀粉添加量为16.15%，TGase 添加量为0.36%，蛋清蛋白添加量为5.56%，此时复合鱼糜凝胶强度的理论最大值为2312.18 g·cm。根据优化后的添加量并结合实际选择马铃薯淀粉添加量为16%，TGase 添加量为0.4%，蛋清蛋白添加量为6%，分别进行三组验证性试验，测得复合鱼糜凝胶强度为2330.60 g·cm，相对于理论预测值误差较小，说明建立的该模型的可行性高，可以相对真实地反映出各因素对复合鱼糜凝胶性能的影响，具有实际应用生产的价值。

2.5 复合鱼糜质构特性的测定

将优化工艺组与普通工艺组复合鱼糜分别进行TPA 试验，其质构特性参数由表4 所示。

由表4 可知，优化工艺组的硬度较普通工艺组硬度值下降了9%，咀嚼性较普通工艺组提高了57%，粘结性较普通工艺组提高了19%，凝胶强度值为破断力与破断距离的乘积，即优化工艺组的凝胶强度较普通工艺组提高了41%。优化工艺组的硬度、咀嚼性、粘结性、破断力与破断距离均显著高于普通工艺组（P<0.05），这与叶丽红等[28]研究相似，优化工艺组添加了蛋清蛋白，蛋清蛋白降低了鱼糜的硬度，对弹性无太大影响，并且优化后的复合鱼糜质构品质得到了提升。

表4 优化工艺组与普通工艺组质构特性参数对比Table 4 Comparison of structure characteristics of optimized process group and blank control group

2.6 复合鱼糜凝胶微观结构的比较

利用扫描电镜对复合鱼糜优化工艺组和普通工艺组样品进行比较研究，结果如图7 所示，伴随着外源添加物作用，复合鱼糜凝胶微观结构发生明显变化，添加外源添加物的优化工艺组的鱼糜凝胶形成较为致密的网状结构，凝胶孔洞较小，表面较为平整[29]，这可能与外源添加物中优化的蛋清蛋白浓度，能够与蛋白质相互作用，改变凝胶强度有关，或者与马铃薯淀粉和TGase的添加量有关，两者结合能够捕获鱼糜中更多的游离水，降低其水分的流失，有助于复合鱼糜凝胶形成致密的凝胶网状结构[30−32]。而普通工艺组的鱼糜凝胶则网络疏松并存在较大的孔隙，且表面凹凸不平，也验证了添加物的作用。

图7 复合鱼糜凝胶微观结构对比Fig.7 Microscopic comparison of composite surimi gel

3 结论

以鲢鱼与鳕鱼制备复合鱼糜，选择外源添加物马铃薯淀粉、TGase 以及蛋清蛋白三种，通过响应面试验优化复合鱼糜凝胶性能，马铃薯淀粉添加量为16%，谷氨酰胺转氨酶（TGase）添加量为0.4%，蛋清蛋白添加量为6.0%，复合鱼糜凝胶强度最大。根据此配方（优化工艺组）所得复合鱼糜质构特性参数中的咀嚼性、粘结性、破断力与破断距离均显著高于未添加外源物普通工艺组（P<0.05），同时优化工艺组的复合鱼糜的扫描电镜图显示其凝胶结构网状结构较为致密，凝胶孔洞较小。根据此配方添加外源添加物有助于改善复合鱼糜凝胶特性，可以制备出品质优良的鱼糜凝胶制品，并为进一步研究复合鱼糜的凝胶机理奠定了良好的基础。