油茶叶提取物的5α-还原酶抑制活性及化学成分分析

崔心禹，夏 琛，金 蒙，苏 远，吴晓琴，沈建福

（浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）

5α-还原酶（5α-Reductase,5α-R）是重要的雄性激素代谢酶，睾酮（Testosterone,T）在5α-还原酶（5α-R）的作用下不可逆地转化双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT），过程中还要依赖还原性辅酶II（NADPH）[1−2]，如图1 所示。DHT 是最强的活性雄性激素，因为它与雄性激素受体（Androgen receptor,AR）的亲和性比T 高2～5 倍，诱导AR 信号传导的效力比T 高10 倍[3−4]可引发雄性激素依赖性疾病比如痤疮、雄激素源性脱发、女性多毛症、前列腺癌、前列腺增生、假两性畸形等[5−6]。

图1 5α-R的作用机理Fig.1 Catalytic reaction process of 5α-R

5α-R 是皮肤中最重要的雄性激素代谢酶，它具有三种同工酶，其中I 型和II 型酶的特征比较清楚，二者的主要区别为5α-RI 主要存在于肝脏及非生殖器官皮肤，其发挥生理作用的最适pH 为范围较宽为6～9，而5α-RII 主要存在前列腺、睾丸、附睾、精囊、头皮毛囊等，其最适pH 为5.5[7−11]。

目前已开发的5α-R 抑制剂包括甾体类和非甾体类，最常见药物如非那雄胺、度他雄胺、爱普列特等。但这些药物存在不良反应，如代表性药物非那雄胺可能对男性造成抑郁、焦虑、认知障碍、勃起障碍、性欲减退、男性乳房女子化、肌肉生长受损等副作用[12−13]，统称为非那雄胺后综合征（Post-finasteride syndrome,PFS）[14]。这些副作用是这类药物本身固有的，难以通过改造结构来消除，因此从天然植物中寻找安全、有效且来源广泛的5α-R 抑制剂替代这些化学合成的抑制剂已成为国内外研究的热点。Niederprüm 等[15]通过体外实验证实了锯叶棕果实提取物具有5α-R 抑制活性以及治疗前列腺增生的效果。Weisser 等[16]发现锯叶棕提取物IDS 89 对人前列腺上皮和间质中的5α-R 具有抑制作用，且属于非竞争性抑制，有效成分是可皂化亚组分中的月桂酸，它对上皮和基质的最大抑制率分别为52%和45%。邓桂球等[17]从雌性大鼠肝脏、雄性大鼠附睾组织中分别提取I 型、Ⅱ型5α-R，采用HPLC 法测定出红花提取物对I 型、Ⅱ型5α-R 活性均有抑制效果，抑制率分别达到88.12%和61.65%。另外也有研究报道大黄[18]非洲臀果木[19]、大荨麻[20]、薰衣草[21]、莲子心[22−23]等植物的提取物具有良好的5α-R 抑制活性，是天然来源的5α-R 抑制剂。

油茶叶是山茶科植物油茶Camellia oleifera的叶，《中华本草》中提到其味微苦，性平，有治疗鼻衄，皮肤溃烂瘙痒，疮疽的功效。罗晓伟等[24]已经证明油茶蒲具有5α-R 抑制活性，油茶叶与油茶蒲同为油茶的重要组成部分，推测油茶叶与油茶蒲可能具有类似的生物活性。本文以5α-R 为研究靶点，旨在探究油茶叶提取物对5α-R 活性的影响，探讨其成为潜在的5α-R 抑制剂的可能性，并分析其化学成分，为其在治疗雄性激素依赖型疾病如痤疮、前列腺癌等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜采摘的油茶叶 浙江省江山市江山之间生物科技有限公司提供；SPF 级别雄性大鼠4 只，体重（200±20）g 由浙江省医学科学院提供，许可证编号SCXK（浙）2019-0002；还原型辅酶II、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；度他雄胺、睾酮、没食子酸、芦丁分析对照品 上海阿拉丁试剂有限公司；色谱级甲醇等有机试剂 均来自国药集团化学试剂有限公司。

Waters e2695 高效液相色谱、Acquity TM Ultra 型超高效液相色谱仪 美国Waters 公司；Luna C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 μm） 美国Phenomenex 公司；Ultimate UHPLC LP-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm,1.8 μm） 上海月旭科技股份有限公司；Sciex Triple TOF 5600+四极杆飞行时间质谱仪 美国AB Sciex 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 粗酶提取物的制备以及5α-R 含量的测定 参考张蓓[25]的方法并稍作修改，取雄性大鼠4 只，禁食不禁水过夜后脱臼处死。迅速取肝脏，剥离脂肪组织，称重，剪碎，置于烧杯，加入预冷的提酶缓冲液（提酶缓冲液[26]：0.32 mol/L 蔗 糖；0.1 mmol/L DTT；1 mmol/L EDTA；20 mmol/L 磷酸盐缓冲液pH7.4）按照1:4（w/v）的比例在冰水浴中用匀浆器匀浆，制成匀浆液，然后将其分装至离心管，在4 ℃、10000×g条件下离心20 min，除去漂浮的脂肪，取上层液体，同样条件下再离心1 h，上清液即为微粒体粗提取物。采用Bradford 法[11]对粗酶提取物定量，以其总蛋白质含量表示5α-R的含量。

1.2.2 5α-R 酶促反应体系的建立与5α-R 活性测定

1.2.2.1 T 标准曲线的制备 配制系列浓度T 溶液：5～2000 μmol/L，将不同浓度T 溶液用0.22 μm 微孔滤膜过滤至液相瓶，进入高效液相色谱仪检测，以峰面积A（AU*min）为纵坐标，以T 浓度C（μmol/L）为横坐标，绘制标准曲线。

液相色谱条件：色谱柱：LunaC18（2）柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）不锈钢柱；柱温：30 ℃；流动相：甲醇/水70/30（V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：242 nm；进样体积：20 μL。

1.2.2.2 5α-R 酶促反应体系的建立 在1000 μL 测活体系中[27]，将300 μL PBS 缓冲液（pH7.4）、500 μL粗酶提取物稀释液、50 μL T、50 μL 50%乙醇、100 μL NADPH 按顺序添依次加至离心管，于旋涡混合仪快速混合均匀3 s，37 ℃恒温水浴锅反应30 min，在t0时刻与t30时刻快速分别取样400 μL，快速加入800 μL 甲醇（甲醇起到失活蛋白酶的作用），涡旋5 s 终止反应[17]。上述反应液在12000 r/min离心15 min，除蛋白，取上清液，0.22 μm 有机相滤膜过滤至液相瓶，待检测。

1.2.2.3 5α-R 活性测定 HPLC 检测比较反应前t0时刻与反应后t30时刻T 峰面积的变化，液相色谱条件同1.2.2.1。将T 峰面积带入T 标准曲线，计算出相应浓度，以及T 浓度的变化量，从而实现测定5α-R的活性。设置不同的反应管包括：空白对照管（酶提取物用甲醇失活）、酶正常反应管、阳性对照管（50%乙醇换成度他雄胺溶液）。

计算公式如下：

式中，Ct0表示0 min 时T 浓度，Ct30表示30 min时T 浓度，ΔT 表示反应前后T 浓度的差值。

式中，定义5α-R 活性（μmol T/（g prot·30 min））为每克酶提取物每30 min 转化T的量，C5α-R（g/L）表示5α-R 粗提取物的浓度，即5α-R 粗提取物蛋白质的浓度。

1.2.3 5α-R 酶促反应体系的优化

1.2.3.1 反应体系中NADPH、T、粗酶提取物适宜添加浓度的确定 将NADPH 用PBS 配制成一系列梯度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性测定方法，在固定5α-R 提取物浓度为0.76 mg/mL、T 浓度为1 mmol/L的条件下，以5α-R 活性为指标，考察NADPH的适宜添加浓度。

将T 配制成一系列梯度：0.1、0.4、1.0、1.5、2.0 mmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性测定方法，在固定 5α-R 提取物浓度 为 0.76 mg/mL，NADPH 浓度为2 mmol/L的条件下，以5α-R 活性为指标，考察T的适宜添加浓度。

以蛋白质浓度表示粗酶提取物的浓度，将其用PBS（pH7.4）缓冲液稀释成系列梯度：0.38、0.76、1.52、3.08、6.16 mg/mL，采用1.2.2 中提到的5α-R活性测定方法，在固定T 浓度为2 mmol/L，NADPH浓度为2 mmol/L的条件下，以5α-R 活性为指标，考察粗酶提取物的适宜添加浓度。

1.2.3.2 反应体系稳定性的考察 确定最终反应体系各个组分浓度条件：0.76 mg/mL 粗酶提取物500 μL，2 mmol/L T 50 μL，样品50 μL，2 mmol/L NADPH 100 μL，分别测定四次空白对照管和酶正常反应管的T 浓度变化，考察反应体系的重复性和稳定性，计算相对偏差RSD。

1.2.3.3 度他雄胺5α-R 抑制活性的测定 度他雄胺是Ⅰ型5α-R 抑制剂，将其为阳性药物并稀释成系列梯度：2、4、6、8、12、16 nmol/L，采用1.2.2 中提到的5α-R 活性测定方法，在适宜的NADPH 浓度、T 浓度、粗酶提取物浓度条件下，把50%乙醇溶液替换成系列浓度的度他雄胺溶液，考察不同浓度度他雄胺对5α-R 活性的抑制率，绘制抑制曲线，计算出度他雄胺对5α-R 活性的半抑制浓度（IC50），公式如下：

1.2.4 油茶提取物的制备及5α-R 抑制活性的测定

1.2.4.1 不同溶剂油茶叶提取物的制备及得率的计算 油茶叶经过挑选去除病变叶后，45 ℃烘箱干燥，粉碎过60 目筛，称取8 份20 g 油茶叶粉末按1:40（w:v）料液比分别加入水、50%乙醇溶液、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚，先搅拌浸泡3 h 再于50 ℃下超声振荡提取两次（2 h/次），4000 r/min 离心10 min 使得固液分离，上清液旋转蒸发减压浓缩除去有机试剂，然后真空冷冻干燥，得到不同极性溶剂的油茶粗提取物分别记为A1～A8，观察其颜色及性状，并计算得率，计算公式如下：

式中，m 为提取物的质量（g），M 为原料干基质量（g）。

1.2.4.2 油茶叶提取物5α-R 抑制活性的测定 分别取A1～A8 冻干粉末，用50%乙醇均配制成200 μg/mL的稀释液，按照1.2.2 测定A1～A8 稀释液对5α-R的抑制率，以5α-R 抑制率为指标，确定最佳制备溶剂，并测定、计算最佳溶剂提取物对5α-R 活性的半抑制浓度（IC50），相关计算公式同公式（3）。

1.2.5 油茶提取物总酚和总黄酮含量的测定 用50%乙醇溶液将A1～A8 配制成1 mg/mL的稀释液，采用Folin-Ciocalteu 法，以没食子酸计，测定不同油茶叶提取物中的总酚含量。标准曲线的制备：配制梯度浓度的芦丁溶液0～50 μg/mL。在1 mL 体系中依次加入100 μL 没食子酸溶液，250 μL的福林酚试剂，250 μL的15%的碳酸钠溶液，再补足400 μL 水至1 mL 终体积。充分混合之后80 ℃水浴放置30 min，静置冷却10 min，4000 r/min 离心5 min，取上清液于778 nm 测定吸光值A778nm。依据没食子酸标准溶液的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线。样品的测定：操作同上，将样品吸光值带入标准曲线，以没食子酸计，算得样品总酚含量[28]。

采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法，以芦丁计，测定不同溶剂植物提取物中总黄酮的含量。标准曲线的制备：精密配制梯度浓度的芦丁溶液0～50 μg/mL。吸取 200 μL 待测芦丁溶液，置于5 mL试管中，加入300 μL 60%乙醇溶液，再加入100 μL亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，加入150 μL 硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，加入400 μL 氢氧化钠溶液，最后加入1.35 mL 60%乙醇溶液至终体系为2.5 mL，摇匀，放置15 min，于510 nm 测定吸光值A510nm。依据芦丁标准溶液的浓度和相应的吸光值绘制标准曲线。样品的测定：操作同上，将样品吸光值带入标准曲线，以芦丁计，算得样品总黄酮含量[29]。

1.2.6 油茶叶提取物化学组分的分析鉴定 参考王微[30]的方法取得8 mg 油茶叶50%乙醇提取物，加入2 mL 甲醇，配制成4 mg/mL的提取物待测液，超声5 min 后用0.22 μm 微孔滤膜过滤至液相瓶中，待测。

色谱柱：C18柱（2.1 mm×150 mm,1.8 μm）；流动相：0.1%甲酸-水溶液（流动相A）和乙腈（流动相B）；梯度洗脱条件：0～10 min，5%～13% B；10～20 min，13% B；20～40 min，13%～20% B；40～60 min，20%～45% B；60～70 min，45%～100% B；进样量：10 μL；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：280 nm。

UPLC-Triple TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100～2000；雾化气（GS1）：55 psi；雾化气（GS2）：55 psi；气帘气（CUR）：35 psi；离子源温度（TEM）：550 ℃（负）；离子源电压（IS）：−4500 V（负）；一级扫描：去簇电压（DP）：100 V；聚焦电压（CE）：10 V；二级扫描：使用TOFMS-ProductIon-IDA 模式采集质谱数据，CID 能量为20、40 和60 V，进样前，用CDS 泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2 ppm。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 5α-R 粗酶提取物蛋白含量的测定

粗酶提取物呈现粉红色，采用Bradford 法对5α-R 粗酶提取物定量，以蛋白质含量表示。测得蛋白质含量的标准曲线为y=0.5753x+0.5269（y 为吸光值，x 为标准蛋白浓度，R2=0.9977），计算得出蛋白质浓度为12.12 mg/mL。

2.2 T的标准曲线

如图2 所示，T 在5～2000 μmol/L 范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y=18110x+116886（R2=0.9998）。

图2 T的标准曲线Fig.2 The standard curve of T

2.3 酶促反应体系的确定

如图3 所示，在0.5～2.5 mmol/L 范围内，随着NADPH 浓度的增加，酶活性不断上升，当NADPH浓度为2 mmol/L 时再增加时对酶活性的影响不大，而且考虑到NADPH 价格昂贵，故最终选择2 mmol/L作为NADPH 在5α-R 酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图4 所示，在0.1～2 mmol/L 范围内，随着T 浓度的增加，酶活性不断上升，选择酶活性最高时对应的2 mmol/L 作为T 在5α-R 酶促反应体系中的适宜添加浓度。如图5 所示，5α-R 提取物浓度在0.38～0.76 mg/mL 范围时，随着提取物浓度增加，酶活力逐渐上升，在浓度为0.76 mg/mL 时达到最高值，之后随着提取物浓度的增大酶活力反而降低，因此确定0.76 mg/mL 为粗酶提取物浓度在5α-R 酶促反应体系中的适宜添加浓度。

图3 NADPH 浓度对5α-R 活性的影响Fig.3 Effect of concentrations of NADPH on 5α-R activity

图4 T 浓度对5α-R 活性的影响Fig.4 The effect of concentrations of testosterone on 5α-R activity

图5 粗酶提取物浓度对5α-R 活性的影响Fig.5 Effect of concentrations of enzyme extract on 5α-R activity

最终确定的反应条件如下：pH 为7.4的磷酸盐缓冲液300 μL，添加浓度为0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，添加浓度为2 mmol/L的T 50 μL，样品50 μL,添加浓度为2 mmol/L的NADPH 100 μL，反应温度为37 ℃，反应时间为30 min。

2.4 酶促反应体系的稳定性

根据2.3 确定的反应条件，分别测定四份空白对照管和酶正常反应管（同一批次）酶活性分别为(6.11±0.16)、(565.53±9.24) μmol T/（g prot·30 min），相对偏差均小于2%，说明该法可重复，此5α-R 酶促反应体系稳定强。

2.5 度他雄胺的5α-R 抑制活性

如图6 所示，当度他雄胺浓度范围为2～16 nmol/L时，阳性药物度他雄胺对5α-R的抑制作用具有量效关系，曲线拟合度良好，根据拟合曲线算得度他雄胺对5α-R的半抑制浓度（IC50）为6.24 nmol/L，有文献报道[25,31]度他雄胺对I 型5α-R的IC50等于6 nmol/L，与本测定值相近，进一步说明5α-R 酶促反应体系可靠有效。

图6 度他雄胺对5α-R的抑制曲线Fig.6 Inhibition curve of dutasteride on 5α-R

2.6 不同油茶叶提取物得率

不同极性溶剂的油茶叶提取物的得率如表1 所示，50%乙醇、甲醇、乙醇、正丁醇油茶叶提取物的得率高均超过20%，其中油茶叶50%乙醇提取物的得率最高达29.02%。这是因为该溶剂的溶解范围广，可以富集大多数的活性成分。

表1 不同极性溶剂对油茶叶提取物得率的影响Table 1 Effect of different polar solvents on the yield of Camellia oleifera leaves extracts

2.7 油茶叶不同溶剂提取物的5α-R 抑制率

根据图7 可知，200 μg/mL的油茶叶提取物对5α-R的抑制活性有影响，油茶叶石油醚提取物对其有促进作用，而其他油茶叶提取物呈现不同程度的抑制作用，其中油茶叶50%乙醇提取物对5α-R 抑制效果最明显，高达49.77%±4.43%，其次，二氯甲烷提取物和甲醇提取物对5α-R的抑制活性也较高，分别为41.26%±0.02%、36.66%±0.71%。由于油茶叶50%乙醇提取物5α-R 抑制率最高，因此最佳制备溶剂为50%乙醇，并将其提取物命名为COLE（Camellia oleiferaLeaves Extract,COLE），测得其IC50为259.56 μg/mL。已知临床上使用度他雄胺的治疗剂量为0.5 mg/d[32]，经过等效换算，若以5α-R 抑制活性为指标，39.35 mg/d COLE 与度他雄胺临床剂量治疗效果相当。

图7 不同油茶叶提取物对5α-R的抑制率Fig.7 5α-R inhibition rate of different Camellia oleifera leaves extracts

2.8 油茶叶提取物的总酚和总黄酮含量及与5α-R 抑制率的相关性分析

A1～A8的总酚、总黄酮含量见表2。Pearson 相关性分析如表3 所示，A1～A8 中总酚、总黄酮含量与5α-R 抑制率相关系数分别为0.609 和0.808，即5α-R 抑制率与油茶叶提取物中总多酚含量在高度正相关（r>0.6），5α-R 抑制率与总黄酮含量存在显著的强正相关（r>0.8，P<0.05），这表明油茶叶提取物中的多酚与黄酮是抑制5α-R的重要物质。

表2 不同油茶叶提取物（A1～A8）总酚和总黄酮含量Table 2 Contents of total phenols and total flavonoids in different Camellia oleifera leaves extracts（A1～A8）

表3 油茶叶提取物的5α-R 抑制率与其总黄酮、总酚含量与之间的相关性Table 3 Correlation rate between 5α-R inhibition rate and total flavonoids,total phenolics in extracts of Camellia oleifera leaves

2.9 油茶叶提取物的化学成分分析

由上述结果可知油茶叶提取物中的多酚与黄酮可能是抑制5α-R的重要物质基础，采用UPLCTriple TOF-MS/MS 对COLE 中的酚类化合物进行定性分析，结果在COLE 中共发现22 种酚类化合物。图8 为负离子模式下的总离子图，表4 为COLE中酚类化合物鉴定结果。Richard 等[33]研究证明芦丁（IC50>100 μmol/L）、槲皮素（IC50=23 μmol/L）具有I 型5α-R 抑制活性。另外还发现儿茶素等茶多酚类物质，在无细胞状态下显示出有效的5α-R 抑制作用，但在5α-R的全细胞分析中抑制作用不明显。周琛媛等[34]在具有高5α-R 抑制活性的油茶蒲聚酰胺组Fr8 中分离纯化（采用固相萃取的方式），通过质谱和核磁共振的手段进行结构鉴定出F1 为3-O-没食子酰基-4,6,-[（S）-六羟基联苯二酰基]-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），F4 为3,4,6-三-O-没食子酰基-α/β-D-吡喃葡萄糖（GAG）。这些物质均在COLE 中被发现，它们是COLE 发挥5α-R 抑制活性的物质基础。

图8 COLE 总离子流图（负离子模式）Fig.8 Total ion chromatogram of COLE（Negative ion mode）

表4 COLE 中酚类化合物的鉴定结果总表Table 4 Identification results of phenolic compounds from COLE

续表 4

3 结论

本研究以5α-R 为研究靶点建立酶促反应体系，通过确定粗酶提取物、NADPH、T的适宜添加浓度优化该体系，确定反应体系如下：PBS 缓冲液（pH7.4）300 μL，0.76 mg/mL的粗酶提取物500 μL，2 mmol/L的T 50 μL，样品50 μL，2 mmol/L的NADPH 100 μL，37 ℃下反应30 min。按照该体系用HPLC 法测量临床上使用的I 型5α-R 抑制剂度他雄胺的5α-R 抑制活性，结果测得其IC50为6.24 nmol/L，证实该法可靠有效。通过重复性试验证实该反应体系具有稳定性。然后用该法进一步测定、比较不同油茶叶提取物5α-R 抑制活性，其中50%乙醇油茶叶提取物的5α-R 抑制活性最高（IC50=259.56 μg/mL），证明50%乙醇油茶叶提取物是潜在的植物来源的5α-R 抑制剂。最后采用UPLC-Triple TOF-MS/MS 对油茶叶提取物中的化学成分进行了分析鉴定，结果共发现22 种酚类化合物，其中槲皮素、芦丁、儿茶素、3-O-没食子酰基-4,6,-[（S）-六羟基联苯二酰基]-α/β-D-吡喃葡萄糖（Gemin D），3,4,6-三-O-没食子酰基-α/β-D-吡喃葡萄糖可能是COLE 发挥5α-R 抑制活性的物质基础。因此本研究证明了油茶叶提取物是天然的5α-R 抑制剂，在治疗雄性激素依赖型疾病方面具有良好的应用前景。