有效分离染发剂中对苯二胺等8种组分的方法

蒋明莉，黄义峰，吴金花(贵州省产品质量检验检测院，贵州 贵阳 550014)

1 概述

随着生活水平的提高，染发越来越普遍，且每个人的染发频次越来越高[1-2]。染料中间体主要成分多为苯胺类化合物，使用后可能引起许多不良反应[3-5]。自1999年卫生部发布我国第一部《化妆品卫生规范》以来，到2007年7月1日卫生部颁布实施的《化妆品卫生规范》(2007年版)，再到2016年12月1日国家食品药品监督管理总局颁布实施的《化妆品安全技术规范》(2015年版)，均规范列出了染发类化妆品中允许使用的染发剂原料，并明确了它们的限制使用要求和标签标注规定。染发产品的安全性极为重要，染发时染发剂或多或少会接触到皮肤上，染发剂中的着色剂对苯二胺等作为致癌的有毒物质，虽然含量未超过国家的限制标准，依然会对人体造成伤害，长期使用染发剂染发将会严重的损害人体健康。因此，染发剂中对苯二胺等物质的分离检测，对于消费者选择和使用染发剂具有非常实际的意义。

高效液相色谱法是目前最理想的检测染料中对苯二胺等物质的方法。目前在实验室进行检测时，发现有的标准文本中提供的实验条件往往在实验室实际情况下无法复原标准文本中的结果，有的标准文本提到的部分实验内容比较晦涩让人很难理解到位。在这些情况下按照标准文本检测不出目标物质时，如何通过改变色谱条件来完成定性定量检测是本文的主要研究目的。本实验通过《化妆品安全技术规范》(2015版)中染发剂检验方法对对苯二胺等8种组分进行检测[6]，来寻找和确定最佳色谱条件并完成检测，为各实验室在新的标准扩项及日常检测中提供一定的参考。

2 实验

2.1 色谱柱的选择

从化妆品安全技术规范2015版的检测方法中，推荐的色谱柱为 C18(250 mm×4.6 mm×10 μm)，流速 2.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温：20 ℃；采用规范中推荐的色谱条件检测对苯二胺等8种组分所得的谱图如图1所示。

图1 按照标准文本的条件所得对苯二胺等8种组分色谱图

从图1可以看出对苯二胺的峰形宽且分裂，甲苯2,5-二胺与氢醌在同一保留时间出峰无法分离。通过降低流速和柱温等条件也无法改善对苯二胺的峰形以及使甲苯2,5-二胺与氢醌有效分离。因此考虑更换内径小及填充粒径小的色谱柱，以提高分离效果。通过实验，C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)和C18(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)等色谱柱填充粒径变小或内径减小的色谱柱均可以达到分离的效果。本文选用了C18(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)色谱柱进行研究，得到如图2所示的色谱图。

从图2可以看出，8种物质都分离了，可是对苯二胺的峰仍然宽且分裂。虽然根据该色谱条件建立的8种物质浓度梯度的校正曲线的相关系数均达0.999，但是对苯二胺峰形太差，仍然需要进一步实验研究。

图2 改变色谱柱所得对苯二胺等8种组分色谱图

2.2 溶剂的选择

一般情况下，在高相液相色谱实验时，为避免所用溶剂与流动相的差异大，制备标准溶液的溶剂与液相的流动相基本是一致的。本标准文本中制备标液溶剂为：95%的乙醇，而流动相则为：含5%乙腈的磷酸缓冲溶液。采用规范中推荐的流动相进行试验，发现所检测的标准物质对苯二胺的峰分裂严重，峰形很不好如图2所示。通过试验，我们用流动相的溶液作为溶剂来配制标准溶液能够解决这个问题，检测的色谱图如图3所示。

从图3可以看出，使用流动相的溶液配制标准溶液，可以很好地改善对苯二胺峰形不好的问题。从图3可以看出邻苯二胺和间苯二胺的分离不好，可以通过改变流速来提高分离度。

图3 改变溶剂所得对苯二胺等8种组分的色谱图

2.3 流速的选择

通常，降低流速可以提高分离度，但是检测时间会变长，提高流速可以节约分析时间，但是分离度会有所降低，把流速从2.0 mL/min调至1.0 mL/min，得到如图4所示的色谱图。

从图4可以看出，对苯二胺等8种组分完成了有效分离检测，且每种组分配制的标准系列的线性范围＞0.999，用此色谱条件可以很好地完成染发类化妆品中对苯二胺等组分含量的检测。

图4 改变流速所得色谱图

同时我们应该明白，降低流速并不能把原本无法分离的物质进行分离，而只是把分离度欠佳的物质进行更好地分离。对于完全无法分离的情况，笔者建议首先改变色谱柱再进行条件探索。在色谱分析中，分离度、分析速度和柱容量三者之间的关系，呈现幻想的三角形，即其中任一因素都要受到另外两个因素的制约，要平衡三者去实现最佳参数的选择。

2.4 流动相pH的调节

本人在实验过程中发现流动相的pH对各组分分离有巨大的影响。在规范中提到，流动相的pH调至7.7，是弱碱性，那么若调节的pH无法刚好为7.7时，调至7.7以下与7.7以上是否有区别呢？以上实验色谱图均是pH调节至7.7稍稍偏上所得的结果，而将流动相pH调节至7.7以下时且用该流动相作为溶剂配制混合标准溶液时得到的色谱图如图5所示。

从图5可以看出，对苯二胺和对氨基苯酚几乎同时出峰，不能有效分离。因此，流动相的pH对检测结果影响很大，并非调节成7.7左右这么笼统而已。在实际分析时，要注意调节的流动相pH对实验结果的影响，避免在实验过程中走弯路。

图5 pH的调节至7.7以下所得色谱图

3 结语

根据以上实验研究，确定检测染发剂中对苯二胺的检测最佳参考色谱条件为：色谱柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)、C18柱(150 mm×3.5 mm×2.1 μm)及等效色谱柱。流动相pH：调至7.7或偏高一点，标准溶液稀释溶剂：与流动相保持一致，流速：1.0 mL/min。使用本文的检测条件能够很好的检测染发剂中对苯二胺等物质，检测的每一种标准物质的线性均在0.999以上，检出限、定量限等满足《化妆品安全技术规范》2015版中检验方法的要求，在检测实际染发剂产品时结果精密度和回收率均满足GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》标准的要求，用以上色谱条件可以得到较好的实验效果。

高效液相色谱法不仅仅是检测染发剂中各组分的最佳方法，同时也是许多物质检测的常规方法，该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术；在使用高效液相色谱法时如何寻找最佳色谱条件，是每一位检测者必须面对的第一课题。本文通过染发剂中对苯二胺等物质检测条件的优化为例，介绍了在使用高效液相色谱法检测时遇到问题时的解决思路，不仅为初学者也为普通检测人员在日常检测和新方法开发时提供一定的参考思路。