肺泡灌洗液效应T细胞斑点试验与RNA恒温扩增实时荧光检测对涂阴肺结核的诊断价值比较

黄 健 张志大 李希玖

江西省胸科医院呼吸与危重症医学科，江西南昌 330006

肺结核是一种由结核杆菌感染肺部导致的传染性疾病，早期症状轻微，随着疾病发展，肺结核患者逐渐出现畏寒、出汗、间歇性咳嗽等症状，随着疾病发展，患者甚至出现咯血现象，严重影响患者身体健康[1]。近年来，随着人们健康意识提升，每年进行健康体检的人群增多，大批无症状结核患者被及早发现，为患者早期治疗、控制结核病蔓延奠定了基础。据全国第五次结核病流行病学抽样调查中，在参与调查的10万人中，活动性肺结核为459 例，占0.46%，其中，涂阴肺结核的患病率占总患病数的85.62%[2]。在诊断结核病时，疾病确诊离不开细菌学，增大了涂阴肺结核快速诊断难度。现有诊断技术中，涂片镜检迅速且便利，但敏感性不足。且结核菌培养时间超过2 周。结核分枝杆菌RNA 恒温扩增实时荧光检测技术（simultaneous amplification and testing for Mycobacterium tuberculosis，SAT-TB）检测迅速，仅需要1～2 h，但容易因外力因素（如污染等）出现假阳性，灵敏度低，对实验员的专业性要求高。因结核的特异性，效应T 细胞会向病变位置集中，依照该特点，本研究收集患者肺泡灌洗液，进行结核感染效应T 细胞斑点试验（T-cell spot test，T-SPOT），通过计算肺泡灌洗液内结核杆菌特异性单核细胞，快速诊断肺结核。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月至12月江西省胸科医院收治的80 例疑似肺结核患者作为研究对象，按照痰涂片检验结果将其分为涂阳组（35 例）与涂阴组（45 例）。涂阳组中，男24 例，女11 例；年龄25～67岁，平均（46.02±4.02）岁；病程2～6 个月，平均（4.42±0.41）个月；肺结核17 例，结核性腹膜炎13 例，其他5 例。涂阴组中，男28 例，女17 例；年龄26～67 岁，平均（46.53±4.47）岁；病程2～6 个月，平均（4.32±0.43）个月；肺结核18 例，结核性腹膜炎12 例，其他5 例。两组患者的年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：①患者既往无结核病史；②患者血清HIV 检测为阴性；③遵循 《肺结核诊断和治疗指南》[3]，对患者肺泡灌洗液均进行SAT-TB、T-SPOT 检测；④患者愿意参与本研且所有患者及其家属均知情同意。排除标准：①精神障碍患者；②合并严重肝、肾、心脏疾病患者；③患者一般资料不全。

1.2 方法

标本采集：使用日本1575k 型电子支气管镜对患者进行检查，于患者肺部CT 影像学检查病灶位置的支气管肺段，将灌洗液（0.9%氯化钠溶液；江西科伦药业有限公司；生产批号：20200912）注入支气管肺泡灌洗，以YX930D 型负压吸引器（上海宝佳医疗器械有限公司）回收灌洗液30 ml，送检验科进行T-SPOT、SAT-TB 检测。

T-SPOT 检测：收集肝素抗凝肺泡灌洗液10 ml，以双层纱布过滤，去除灌洗液内杂质，在离心机内以离心半径5 cm、离心速度1200 r/min 离心10 min，去除上层清液，留下层浓液，分离其中单核细胞，调节细胞数达2.5×105/ml，选择T-SPOT 试剂盒，根据说明书进行操作，步骤如下：将单核细胞分离，和培养滤过蛋白CFP-10、结核特异性抗原分泌靶向抗原ESAT-6放于抗γ-干扰素抗体预包被板内孵育，恒温37℃，孵育16～20 h。使用ELR06IFL 型自动读板仪（德国艾迪公司）对斑点计数，无反应对照0～5 孔点，有反应标本为：抗原A/B 点数-无反应对照孔6 点为阳性；若无反应对照孔点≥6，有反应标本为：抗原A/B 点数≥无反应对照孔的2 倍为阳性。

SAT-TB 检验：在肺泡灌洗液内添加4%氢氧化钠溶液，使灌洗液内黏液液化，采用检测试剂盒检测，并依照说明书操作。注意：液化体积不高于标本量1 倍。

1.3 观察指标及评价标准

①观察涂阴组与涂阳组患者肺泡灌洗液T-SPOT检测阳性率，阳性率=阳性例数/总例数。②以分子生物学检查结果为金标准，观察T-SPOT 与SAT-TB 在涂阴肺结核检测中的准确率、灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）与阴性预测值（negative predictive value，NPV）。准确率=（真阳性+真阴性）例数/总例数×100%，灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性+假阳性）×100%，PPV=真阳性/（真阳性+假阳性）×100%，NPV=真阴性/（真阴性+假阴性）×100%。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，两组间比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者肺泡灌洗液T-SPOT 检测结果的比较

涂阳组患者的阳性率为97.14%（34/35），高于涂阴组的75.56%（34/45），差异有统计学意义（χ2=7.196，P=0.007）。

2.2 涂阴组患者T-SPOT 与SAT-TB 在涂阴肺结核中检验结果的比较

T-SPOT 检测的准确率为93.33%（42/45），高于SAT-TB 检测的80.00%（36/45），差异有统计学意义（χ2=7.688，P=0.006）（表1）。

表1 涂阴组患者T-SPOT 与SAT-TB 在涂阴肺结核中的检验结果（例）

2.3 T-SPOT 与SAT-TB 检测涂阴肺结核的灵敏度、特异度、PPV 与NPV

T-SPOT 检测的灵敏度、NPV 高于SAT-TB 检测，差异有统计学意义（P＜0.05）。两种检测方式的特异度、PPV 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 T-SPOT 与SAT-TB 检测涂阴肺结核的灵敏度、特异度、PPV与NPV[%（n/N）]

3 讨论

目前结核病仍是全球主要传染病之一，致死率高，危害性大，若能够及早发现结核病并治疗，对控制结核病具有重要意义[4-6]。结核杆菌的确诊，离不开细菌学、病理学，细菌学应用较为广泛，但是，部分细菌检测为阴性者也可能感染肺结核，易发生诊断疏漏，不利于结核病筛查与控制，而病理学检测虽然准确，但耗时长，不利于普及。随着微创技术的完善和腔镜器械的广泛应用，已有诸多研究[7-9]证实肺泡灌洗液相关检测可显著提升结核病诊断阳性率。

T-SPOT 作为酶联免疫斑点检测技术，以结核患者特异性T 细胞的免疫应答作为基础，检验抗原释放的γ-干扰素，当受检人体内受到结核杆菌的抗原刺激，T 淋巴细胞致敏，并再次与同类抗原相遇，将释放γ-干扰素[10-12]。通过检测单细胞内分泌γ-干扰素的数目，判断受检人是否感染结核杆菌。并且，活动性肺结核患者的特异性T 细胞扩大与克隆会浓缩于患者病灶部位，因此，以T-SPOT 检测受检人的肺泡灌洗液，能够准确区分受检人为活动性结核或者潜伏性结核[13]。本研究结果显示，T-SPOT 检测下，涂阳组的阳性率（97.14%）高于涂阴组（75.56%），差异有统计学意义（P＜0.05）。对涂阴组检测时，T-SPOT 检测涂阴肺结核的阳性率（94.29%）高于SAT-TB 检测（77.14%），差异有统计学意义（P＜0.05）；T-SPOT 检测的灵敏度、NPV 高于SAT-TB 检测，差异有统计学意义（P＜0.05）；两种检测方式的特异度、PPV 比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示T-SPOT 检测效果更加准确，值得推广。在王琳等[14]的研究中，T-SPOT 检查的灵敏度较高，为91.1%，与本研究结果一致。T-SPOT 检测用时短，特异度高，可能和涂阴肺结核的结核杆菌数量较少相关，即使利用灌洗液在病灶处收集结核杆菌，结核杆菌的数量依然有限，而T-SPOT 检测技术主要检测单个核细胞内抗原致敏T 细胞的数量，并非检测细菌数量，因此，与其他检测方式比较，T-SPOT 检测的特异性高，敏感性强，诊断价值高[15-18]。

综上所述，肺泡灌洗液效应T 细胞检测在涂阴肺结核中的灵敏度高，且检测速度快，在肺结核筛查中具有重要意义，值得推广。