BMI-1和MMP-3基因多态性与汉族群体乳腺癌易感性的关联分析

张明龙 王秀华 吕 莹 李鹏辉 刘 丹 梅庆步 刘万全 郑立红▲

1.齐齐哈尔医学院遗传学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院生物技术实验中心，黑龙江齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江齐齐哈尔 161006

乳腺癌是常见的多基因遗传的恶性肿瘤，严重威胁女性的健康。基于全基因组关联分析（genome wide association study，GWAS）的研究，乳腺癌易感基因谱正不断完善。目前已经确定了150 多个与乳腺癌风险有关的基因位点[1]。然而，乳腺癌发病的靶基因和具体机制仍然不明确。因此，对不同群体的乳腺癌易感基因的筛查对乳腺癌患者的早期诊断和个体化治疗至关重要。B 细胞特异性白血病病毒插入位点-1（Bcell-specific moloney leukemia virus insection site 1，BMI-1）基因作为原癌基因，可以通过编码多梳蛋白抑制抑癌基因的活性，在肿瘤细胞发生发展和肿瘤干细胞的维持上起到关键作用[2]，BMI-1 基因可以通过核转汞因大（nudear factor κB，NF-κB）/金属蛋白酶-3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）通路增强肿瘤细胞的转移和侵袭能力[3]。基质MMP-3 基因可编码基质溶解酶，与肿瘤的血管侵袭和淋巴转移有密切关系[4]。本研究选取BMI-1 基因rs1042059、rs201024480以及MMP-3 基因rs3025058 位点，对黑龙江地区汉族女性乳腺癌患者进行易感基因筛查，评估上述基因与乳腺癌易感性的关联，以期为乳腺癌患者的诊治提供遗传学基础数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2018年7月黑龙江省齐齐哈尔市和大庆市（齐齐哈尔医学院附属第二、三医院、齐齐哈尔建华医院和大庆油田总医院）524 例汉族女性乳腺癌患者作为病例组。乳腺癌患者纳入标准：经过病理诊断确诊。排除标准：患有其他癌症和接受过放疗或化疗，患者彼此之间无亲属关系。选取同期进行健康体检的518 例健康体检者作为对照组。对照组纳入标准：健康个体。排除标准：肿瘤家族史、肿瘤家族史和癌前病变者，如宫颈炎、疣和癌前病变。本研究通过医院医学伦理委员会审核批准，并遵循知情同意原则。

1.2 方法

1.2.1 样本信息和临床资料

本研究所有样本基本信息和临床资料信息均同步获取于各医院。乳腺癌样本的基本信息包括年龄和月经初潮年龄，临床资料包括绝经年龄、肿瘤家族史、肿瘤分期（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期）、肿瘤大小（T1～T4）[3]和有无淋巴结转移情况。对照组只收集基本信息（年龄和月经初潮年龄）。

1.2.2 DNA 提取与基因分型

采用人类基因组DNA 提取试剂盒（北京艾德莱）对上述样本的基因组DNA 进行提取，所得DNA于-80℃保存。采用微量分光光度计（北京奥盛）对DNA样本进行定量。采用PCR-LDR 技术（华大蛋白）对BMI-1 基因外显子区域的2 个功能性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点：包括rs1042059（18Cys＞Tyr）、rs201024480（310Ser＞Asn）和MMP-3 基因启动区域的rs3025058 位点进行基因分型，引物及探针的合成遵循基因源序列。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0 和Haploview 4.2 统计学软件进行数据分析，计量资料使用均数±标准差（±s）表示，采用t检验或Mann-WhitneyU检验分析两组间的计量资料信息；计数资料采用率表示，两组间比较采用χ2检验，拟合优度χ2检验Hardy-Weinberg 平衡；通过对混杂因素进行校正以后，采用非条件性logistic 回归分析法评估乳腺癌的发病风险，风险值 （OR）和95%置信区间（CI）表示患病风险。采用HaploView 4.2进行连锁分析和单倍型分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 样本基本特征和比较分析

病例组和对照组的基本信息和临床资料信息见表1。通过进行组间比较，两组的年龄、月经初潮年龄和肿瘤家族史比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，在后续的logistic 回归和单倍型分析中，需要进行校正。病例组中，5.95%有肿瘤家族史，且绝经年龄平均在50 岁左右。肿瘤大小T1、T2、T3和T4分别占49.69%，42.77%，3.77%和3.77%；肿瘤分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期分别占4.63%、49.27%和46.10%；淋巴结呈阳性者占42.47%。

表1 样本基本特征和比较分析

2.2 平衡性检验和连锁分析

Hardy-Weinberg 平衡检测结果显示，3 个多态性位点在两组间的基因型分布观察值与期望值无显著性差异（P＞0.05），提示该研究群体具有良好的遗传代表性。连锁分析结果显示，BMI-1 基因rs201024480、rs1042059 位点之间不存在连锁遗传，可构成单倍型进行后续分析。

2.3 BMI-1 基因多态性与乳腺癌易感性的关联分析

BMI-1 基因rs201024480 和rs1042059 属于低外显率突变位点，突变型等位基因A 和G 在群体里频率极低，杂合子基因型GA 和AG 基因型频率同样很低，且等位基因和基因型频率分布在两组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。鉴于两位点的突变纯合子较少，本研究在显性模型（AA/AG+GG）和加性遗传模型（AA/AG/GG）下对乳腺癌的风险进行预测。在校正年龄、月经初潮年龄和肿瘤家族史因素后，rs201024480、rs1042059 的多态性与乳腺癌的发病风险无相关性（OR=0.94，1.03；95%CI=0.36～2.42，0.27～3.97；P=0.892，0.965）。同样，由两位点组成的单倍型G-A 和A-A 与乳腺癌发病风险无相关性（OR=1.08，95%CI=0.49～2.39，P=0.842）。BMI-1 基因多态性与乳腺癌易感性的关联分析见表2。

表2 BMI-1 基因两个位点基因多态性在与乳腺癌发病风险的关联分析

2.4 MMP-3 基因多态性与乳腺癌易感性的关联分析

两组间MMP-3 基因rs3025058 位点多态性的比较，差异有统计学意义（P＜0.05），突变纯合型5A5A携带者患乳腺癌的风险较对照组高约1.51 倍。在校正年龄、月经初潮年龄和肿瘤家族史因素后，显性模型（AA/AG+GG）下，两组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05，OR=1.51，95%CI=1.17～1.94，P=0.001）。加性模型（AA/AG/GG）下，两组间比较，差异无统计学意义（Pchi＜0.05，OR=1.48，95%CI=1.16～1.91，Plog=0.002）。MMP-3 基因多态性与乳腺癌易感性的关联分析见表3。

表3 MMP-3 基因多态性在与乳腺癌发病风险的关联分析

3 讨论

BMI-1 基因作为编码多梳蛋白抑制复合体的一部分，参与维持复合体的完整性，在组蛋白H2A 的泛素化修饰中起关键作用，参与并影响细胞增殖、DNA修复、凋亡和衰老等多个过程[5]。其过表达与肿瘤的侵袭性、转移性以及放化疗敏感性和预后密切相关[6]，在乳腺癌、原发性肝细胞癌、胃癌、卵巢癌、头颈部癌、胰腺癌和肺癌等多种癌症中均可见过表达。本研究选取位于BMI-1 基因外显子区域的2 个SNP 位点：rs1042059（18Cys＞Tyr）和rs201024480（310Ser＞Asn），其中rs1042059 位置的多态性影响了组蛋白的泛素化修饰[7]。许多研究[8-10]表明，BMI-1 可以通过调控NF-κB/MMP 和PTEN/P13K/Akt 通路增强肿瘤细胞的转移和侵袭能力。本研究结果显示，BMI-1 基因rs1042059、rs201024480 位点与乳腺癌的发病风险不具有相关性。其原因可能是本研究选取的基因位点数量有限。因此，并不能从总体的累加效应水平或者基因间的交互效应的角度去确定该基因是否可以被排除做为乳腺癌的候选易感基因。BMI-1 基因多态性与汉族女性乳腺癌易感性的关系尚需进一步验证，需要更多基因位点、更大样本和精心设计的实验研究。

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族是一类分泌型锌依赖型内肽酶，参与细胞外基质和基底膜的降解、肿瘤的增殖、血管生成、侵袭和转移过程[11-12]。MMP-3 基因可通过降解纤连蛋白和胶原纤维参与细胞外基质的调节，其过表达与包括乳腺癌在内的各种肿瘤的转移和生长有关[13]。有关MMP 的基因多态性与乳腺癌的关联分析研究较多[14-16]，其中MMP-3 基因中研究较多的是位于启动子区域-1171的6A/5A 位点，即rs3025058。该位点在不同族群中的多态性差异较明显，其多态性与乳腺癌易感性的关联也在不同族群中存在明显差异[13，17-18]。鉴于此，本研究对黑龙江地区汉族女性乳腺癌患者与MMP-3 基因的易感性进行检测和评估。本研究结果显示，MMP-3 rs3025058 基因多态性与乳腺癌发病风险存在相关性（P＞0.05），携带5A 等位基因和5A5A 基因型群体患乳腺癌风险比对照组提高约1.5 倍。并且，已有研究[19]证明5A 等位基因比野生型6A 具有更高的转录活性，由此可见，5A 等位基因更有利于乳腺癌的发生发展。

基于以上研究结果和讨论，本研究仍存在一些局限性。第一，单纯的病例-对照研究并不能从生物学上完全证明乳腺癌发病和多基因遗传的具体关系，仍然依靠于功能学的相关深入研究；第二，明确靶基因是否可作为乳腺癌易感基因，单一SNP 位点的检测是不足以证明的，后续将进一步筛选更多位点，从多个位点所构成的单倍型、累加效应和交互作用等角度分析关联性；第三，本研究群体较为局限，只限于黑龙江省地区汉族女性群体，并不能代表中华地区汉族群体总体关联水平，后续应对不同群体的关联研究进行汇总和meta 分析，以排除多群体混淆的干扰。

综上所述，MMP-3 基因rs3025058 位点多态性与乳腺癌发病风险具有相关性；可为本地区乳腺癌患者的早期筛查、诊断及个体化治疗提供参考依据。