Polo样激酶1在幽门螺杆菌感染慢性萎缩性胃炎癌前病变中的表达及意义

李永娟,刘永香,刘 倩,赵俊精,刘国通

(河北省廊坊市人民医院1消化科,2针灸科,河北 廊坊 065000)

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引发消化性溃疡、慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）等消化系统疾病的公认因子，Hp感染可引发胃上皮细胞损伤，改变其增殖及凋亡，导致胃黏膜病变甚至癌变[1-2]。Polo样激酶1（polo like kinase 1，PLK1）是一种苏氨酸/丝氨酸激酶，可调控细胞胞质分离、有丝分裂及DNA损伤应答等行为，高表达于肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤[3-4]。既往研究显示[5]，PLK1在胃癌干细胞中高表达，且参与胃癌干细胞静止与活动状态之间的转化及胃癌干细胞的增殖过程。另有研究显示[6]，靶向抑制PLK1表达可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。因此，推测PLK1可能参与胃癌的发生和发展过程。目前，关于PLK1在CAG癌前病变各阶段中的表达变化研究尚少，且其对胃癌细胞恶性行为学的影响尚不明确。人正常胃黏膜上皮细胞GES-1作为永生化细胞株，因其基本上保留了正常细胞的骨架结构，故是目前较为理想的Hp共培养模型细胞。本研究通过比较PLK1在Hp感染及未感染CAG癌前病变不同阶段患者胃黏膜中的表达情况，并采用PLK1抑制剂BI2536干预Hp与GES-1细胞共培养模型，观察其对Hp诱导的GES-1细胞增殖、凋亡的影响，为胃癌的临床防治提供理论依据。

1 研究对象、材料与方法

1.1 研究对象选取2017年1月-2021年1月在河北省廊坊市人民医院接受胃镜检查的260例患者，根据胃黏膜病理检查分为浅表性胃炎组95例、CAG伴低级别上皮内瘤变（L-IN）组70例、CAG伴高级别上皮内瘤变（H-IN）组65例、胃癌组30例。浅表性胃炎组男性61例，女性34例，年龄20～74岁，平均（45.27±7.48）岁，病程6个月～18年，平均（4.04±1.53）年；LIN组男性40例，女性30例，年龄22～74岁，平均（46.36±7.32）岁，病程6个月～17.5年，平均（4.89±1.68）年；H-IN组男性39例，女性26例，年龄22～74岁，平均（46.36±7.32）岁，病程6个月～20.5年，平均（5.19±2.68）年；胃癌组男性19例，女性11例，年龄22～71岁，平均（47.41±7.80）岁，病程7个月～20年，平均（5.05±2.74）年。4组性别、年龄、病程临床资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准（伦理审批号：LFSRMYY-IRB-2019-013），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 纳入、排除标准纳入标准：（1）所有患者均符合《中国慢性胃炎共识意见》中相应诊断标准[7]，且经胃镜检查确诊；（2）经免疫组织化学染色法及快速尿素酶实验联合检测为Hp阳性，Hp阴性检测结果为Hp阴性[8]；（3）精神正常，可配合完成研究；（4）均签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他部位恶性肿瘤者；（2）糜烂性胃炎、急性胃黏膜病变、出血性胃炎、腐蚀性胃炎者；（3）近6个月使用过抗生素、抗炎药物、抑酸药物、益生菌制剂者；（4）合并严重心血管疾病、全身性代谢性疾病或肝肾功能不全者；（5）幽门梗阻性疾病者。

1.3 材料人胃上皮细胞GES-1，购于上海淳麦生物科技有限公司；Hp标准菌株NCTC11637，来源于中国疾病预防控制中心；浅表性胃炎，CAG伴L-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者胃黏膜组织，于本院消化内镜中心进行胃镜检查时留取，液氮保存。PLK1抑制剂BI2536，纯度99.19%，购自北京百奥莱博科技有限公司。

1.4 主要试剂、仪器兔抗人PLK1一抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二甲基噻唑（dimethylthiazole，MTT）溶液、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液、PI染液（美国Sigma公司）。Glite UV凝胶成像系统（江苏伟禾生物科技有限公司）；Amnis®ImageStream®X MKⅡ流式细胞仪（德国Luminex公司）。

1.5 方法

1.5.1 实时荧光定量聚合酶联反应检测胃黏膜组织PLK1表达量 取液氮保存的胃黏膜组织，充分剪碎后Trizol法提取组织中总RNA，用逆转录获取cDNA，产物经鉴定后，进行实时荧光定量PCR，按照试剂盒说明书设定25μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq 12.0μL，10μmol/L的上下游引物各1.0μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.0μL；反应条件为95℃预变性4 min，95℃变性20 s，57℃退火35 s，72℃延伸45 s，重复38个循环。以GAPDH为管家基因，用2-△△CT计算PLK1 mRNA表达量。引物序列：PLK1：F:5'-ATGCGTAGTGCTGATGCGTGA-3',R:5'-CGTAGTGCGTGATGCTGATGC-3';GAPDH:F:5'-TAGCGTATGCTGTGATCGT-3',R:5'-GTAGCTGATGCTAACCTGC-3'。

1.5.2 GES-1细胞培养 GES-1细胞培养于DMEM培养基（含有10%FBS、1%双抗）及标准环境（5%CO2、37℃饱和湿度）中。观察到细胞贴壁80%左右时，经0.25%胰蛋白酶（含0.01%EDTA）消化、传代。

1.5.3 Hp培养 培养于布氏培养基中（含有抗生素混合液与5%脱纤维冻融兔血），烛缸培养3 d（37℃饱和湿度），采用接种环轻刮培养基上Hp活菌，PBS悬浮，分光光度计测定吸光度，采用DMEM培养基（含有10%FBS、无双抗）调整菌液浓度至1×108cfu/mL。在生物安全三级实验室（BSL-3）操作。

1.5.4 Hp与GES-1细胞共培养、分组、干预 将GES-1细胞按照2.4×104个/孔接种于96孔板，采用完全随机化方式分为空白组、对照组、BI2536组，每组设置5个平行孔。空白组不做处理，对照组、BI2536组按照细菌∶细胞=1∶50的比例与细菌悬液混合。对照组加入正常DMEM培养基培养，BI2536组加入终浓度为20 nmol/L的BI2536S培养。

1.5.5 实时荧光定量聚合酶联反应检测细胞PLK1表达量 取空白组、对照组、BI2536组细胞，总RNA提取、逆转录、反应体系及条件设置方式同1.5.1，以GAPDH为管家基因，用2-△△CT计算PLK1 mRNA表达量。

1.5.6 MTT实验检测增殖能力 取各组细胞，在干预至24、48、72 h时，加入新制备的0.5%MTT溶液，每孔20μL，静置2 h后弃去上清，加入DMSO溶液，每孔150μL，振荡25 min使混合完全，静置2 h后取上清，酶标仪测定A490nm。A值越大，细胞增殖能力越强。所有操作重复3次，取均值。

1.5.7 Annexin V/PI双染法检测凋亡能力 取各组细胞，干预至48 h时，binding buffer标记液充分洗涤，3 000 r/min离心后弃上清，加入binding buffer标记液重悬，与AnnexinV-FITC 5μL混合均匀，4℃遮光孵育20 min，加入PI染液5μL混合均匀，遮光孵育30 min，流式细胞仪在60 min内检测凋亡率。所有操作重复3次，取均值。

1.6 统计学处理采用SPSS 21.0统计学软件处理、分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本计量资料采用方差分析检验，以LSD-t检验分析两两样本。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达量比较与浅表性胃炎组和CAG伴L-IN组比较，CAG伴H-IN组及胃癌患者胃黏膜PLK1表达量升高，且胃癌组高于CAG伴H-IN组，差异均有统计学意义（P<0.05）；浅表性胃炎组和CAG伴L-IN组比较，胃黏膜PLK1表达量无差异（P>0.05）。见表1。

表1 CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达量比较（±s）

表1 CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达量比较（±s）

注：与浅表性胃炎组比较，a P<0.05；与CAG伴L-IN组比较，b P<0.05；与CAG伴H-IN组比较，c P<0.05。

组别浅表性胃炎组CAG伴L-IN组CAG伴H-IN组胃癌组F值P n 95 70 65 30 PLK1表达量0.19±0.04 0.20±0.05 0.36±0.05ab 0.95±0.06abc 172.987<0.001

2.2 Hp阴性、Hp阳性CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达比较Hp检测结果显示，Hp阳性患者103例（浅表性胃炎组26例、CAG伴L-IN组23例、CAG伴H-IN组33例、胃癌组21例），Hp阴性患者157例（浅表性胃炎组69例、CAG伴L-IN组47例、CAG伴H-IN组32例、胃癌组9例）。Hp阳性CAG患者PLK1表达量为（0.59±0.05），Hp阴性CAG患者的PLK1表达量为（0.21±0.04），与Hp阴性CAG患者比较，Hp阳性CAG患者PLK1表达量显著升高（t=63.290，P<0.001）。

2.3 Hp阳性CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达比较与Hp阳性浅表性胃炎组和CAG伴L-IN组比较，Hp阳性CAG伴H-IN组及胃癌患者胃黏膜PLK1表达量升高，且胃癌组高于CAG伴H-IN组，差异均有统计学意义（P<0.05）；浅表性胃炎组和CAG伴L-IN组比较，胃黏膜PLK1表达量无差异（P>0.05）。见表2。

表2 Hp阳性CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达量比较（±s）

表2 Hp阳性CAG癌前病变不同阶段患者PLK1表达量比较（±s）

注：与浅表性胃炎组比较，a P<0.05；与CAG伴L-IN组比较，b P<0.05；与CAG伴H-IN组比较，c P<0.05。

组别浅表性胃炎组CAG伴L-IN组CAG伴H-IN组胃癌组F值P n 26 23 33 21 PLK表达量0.28±0.04 0.30±0.05 0.57±0.06ab 1.35±0.13abc 997.618<0.001

2.4 空白组、对照组、BI2536组细胞中PLK1表达比较空白组、对照组、BI2536组细胞中PLK1表达量分别为（0.08±0.01）、（0.47±0.06）、（0.24±0.04），与空白组比较，对照组、BI2536组细胞PLK1表达量升高（t=14.337，P<0.001；t=8.677，P<0.001）；与对照组比较，BI2536组细胞PLK1表达量降低（t=7.132，P<0.001）。

2.5 PLK1抑制剂BI2536对GES-1细胞增殖的影响24、48、72 h三个时刻MTT实验A值组间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；与空白组比较，对照组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值均降低（P<0.05）；与对照组比较，BI2536组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值均升高（P<0.05）。见表3。

表3 各组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值比较（±s）

表3 各组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值比较（±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05。

组别空白组对照组BI2536组F值P 24 h 0.51±0.09 0.26±0.04*0.38±0.04#20.752<0.001 48 h 0.62±0.10 0.34±0.05*0.48±0.06#18.261<0.001 72 h 0.74±0.08 0.49±0.06*0.61±0.07#15.738<0.001

2.6 PLK1抑制剂BI2536对GES-1细胞凋亡的影响空白组、对照组、BI2536组细胞凋亡率分别为（30.47±7.44）%、（49.57±7.38）%、（41.29±5.31）%，凋亡率组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；与空白组比较，对照组凋亡率升高；与对照组比较，BI2536组凋亡率降低（P<0.05）。见图1。

图1 流式细胞仪检测各组凋亡率

3 讨论

胃癌发生是机体、环境多种因素综合作用的结果，是一个多阶段、多因素、多步骤的发展过程，其演变过程从浅表性胃炎到CAG，后发展至低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变，直至胃癌，CAG到肠上皮化发生、低、高级别上皮内瘤变作为胃癌发生、发展的关键阶段，被称作癌前病变[9-10]。因此，对该阶段进行干预是预防胃癌发生的有效方式。Hp感染可导致胃黏膜上皮细胞增殖与凋亡的失衡，诱发以生长抑制或增生为主要表现的疾病如CAG、肿瘤等临床结局。本研究所选菌株Hp NCTC11637是I型毒力菌株，可同时表达CagA、VacA毒力因子，具有较强毒性，在细菌与细胞比例为1∶50时即可获取较好的感染效果[11]。PLK1抑制剂BI2536属于二氢蝶啶酮类化合物，体外细胞实验已证实其在胶质母细胞瘤中表现出较为满意的抗肿瘤活性，但关于其对Hp与GES-1共培养模型增殖、凋亡的影响尚少[12]。

细胞异常增殖、凋亡与一系列胃肠疾病的发生及正常细胞发生癌性转变密切相关。Hp感染不仅可直接导致细胞凋亡，其引发的炎症反应也起到一定的细胞凋亡诱导作用，胃黏膜细胞数量逐渐减少，形成胃黏膜萎缩、溃疡。为维持增殖与凋亡的平衡，胃黏膜上皮细胞将发生代偿性增殖，不断扩大增殖带，加快细胞更新速率[13-14]。在消化性溃疡、CAG发生、发展的过程中可能发生细胞过度凋亡但无对应细胞加速增殖，在胃癌进程中则可能发生细胞迅速增殖，而无凋亡增加，显著增加恶变风险。在Hp清除成功的CAG患者中，细胞增殖及凋亡指数可逐渐恢复正常[15]。本研究结果显示，与浅表性胃炎组和CAG伴L-IN组比较，CAG伴H-IN组及胃癌患者胃黏膜PLK1表达量升高，且胃癌组高于CAG伴H-IN组，Hp阳性患者PLK1表达量高于Hp阴性患者；Hp阳性的浅表性胃炎、CAG伴L-IN、CAG伴H-IN、胃癌患者PLK1表达量依次升高，提示随癌前病变阶段的发展，PLK1表达逐渐升高，且在Hp阳性患者中更高。

此外，本研究结果显示，与空白组比较，对照组、BI2536组细胞PLK1表达量升高，与对照组比较，BI2536组细胞PLK1表达量降低；对照组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值均低于空白组，凋亡率高于空白组，而BI2536组24、48、72 h三个时刻MTT实验A值均高于对照组，凋亡率低于对照组，提示Hp对GES-1细胞具有增殖抑制及凋亡促进作用，而PLK1抑制剂BI2536可显著拮抗该作用。PLK1不仅可通过直接调控细胞周期引发其异常增殖，还会与多种抑癌基因发生作用，参与调节细胞恶性转化。磷酸酶及张力蛋白同源物（phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN）是重要的抑癌基因，在多种恶性肿瘤如胃癌中均发生PTEN失活，且其失活受到多层次调控[16-17]。研究表明[18]，PLK1可诱导PTEN碳尾端位点磷酸化，改变其结构域，使其失去磷酸酶活性，扰乱其对下游基因的调节作用，影响细胞功能，从而增加肿瘤易感性。张耀中等[19]在研究PLK1基因对胃癌细胞肿瘤生物学行为的影响时发现，通过转染PLK1 siRNA阻断其表达，可抑制胃癌的生长和侵袭转移，提示下调其表达对抑制肿瘤活性具有积极作用。

综上所述，胃黏膜PLK1表达量在Hp感染的CAG癌前病变进程中逐渐升高，PLK1可作为临床中胃癌的早期筛检的潜在指标，具有重要临床意义。细胞实验结果表明，靶向抑制人胃上皮细胞GES-1中PLK1的表达可显著降低Hp对GES-1细胞增殖和凋亡的抑制作用，进一步为PLK1作为胃癌治疗的可靠靶点提供了理论依据。在下一步的研究中，应进一步开展动物体内试验，为本研究结论提供更多、更充分的理论依据。