胃食管反流病动物模型的研究进展

陈 棒,王 丹,赵 希

(吉林大学第一医院 胃肠内科，吉林 长春130021)

胃食管反流病(GERD)是临床常见病，烧心和反流是其典型症状，根据黏膜损伤程度又进一步分为反流性食管炎(RE)，非糜烂性反流病(NERD)及巴雷特食管(BE)[1]。GERD的病因和发病机制尚未完全阐明，目前认为是多种因素造成的以食管下括约肌功能障碍为主的胃食管动力障碍性疾病。而GERD相关动物模型的制备对于发病机制的研究、诊断及筛选治疗药物等方面具有重要的临床价值。其中RE因其存在器质性病变，易于通过动物模型研究其发病机制，故而在有关GERD的动物实验中应用较多。本文对与GERD动物模型制备相关的方法及评价综述如下。

1 建立GERD动物模型

目前GERD动物模型的制备主要包括三种基本类型：自然模型，外科模型和遗传模型[2]。自然模型是指通过外源性灌注化学反流成分诱导食管炎。外科模型是通过外科手术改变动物胃肠道自然解剖结构诱导食管炎，包括胃反流、混合反流、十二指肠反流和食管移植。而遗传模型则是通过基因改造而制备的转基因小鼠模型，常用于巴雷特食管和食管腺癌(EAC)动物模型的建立。此外，近年来通过内镜干预如内镜下环形肌切开制备GERD动物模型等，为GERD大型动物模型制备提供了一种新颖、微创、成功率较高的方法选择。

1.1 自然模型

自然模型是指通过外源性食管灌注(EEP)诱导食管炎。食管灌注方法主要用于一些短期制备GERD动物模型的实验，是指将食管上皮暴露于某些化学溶液(如酸、胆盐、胃蛋白酶等反流物)，控制反流物的浓度和暴露时间，目的是明确反流液对食管黏膜的损伤因子及其作用机制。Li 等[3]设计了一种允许持续输注测试物质或药物的长期给药方法：在食管上部插管，连接到皮下渗透微泵，通过手术放置的插管将胆汁和酸以一定的速率连续灌注到食管腔，观察到7d后即可引起RE的组织细胞学损伤。王宏伟等[4]通过混合灌注盐酸和猪胆汁建立了家兔GERD模型，对比生理盐水灌注组，灌注操作后分别对食管黏膜进行肉眼观察、HE染色光镜下病理观察及电镜下细胞超微结构观察。该实验操作未破坏动物食管、胃、十二指肠的生理解剖结构，在较短时间内成功制备了家兔GERD模型。Pardon等[5]设计了一种活体兔食管灌注模型，将55只麻醉家兔，分别用pH7.2、pH5.0[包括含200 μM和500 μM脱氧胆酸(DCA)]、pH1.0的不同溶液灌注食管30 min，然后分别于灌注后即刻、24 h、48 h时处死动物，通过检测食管黏膜细胞的跨上皮电阻、上皮细胞间隙扩张和细胞凋亡情况，发现含有DCA的弱酸性溶液可诱导上皮细胞凋亡，并对黏膜完整性造成长期损害。此类急性食管灌注建模实验操作流程相对简单，术后动物存活率高，但由于人体内反流物成分复杂，实验灌注成分相对单一，无法精确模拟RE形成的自然病理过程[6]。

1.2 外科模型

手术制备GERD动物模型是通过胃肠道手术建立模型，属于慢性实验，主要用于明确长期食管内反流的病理变化及发病机制，是建立RE、NERD及巴雷特食管模型较为普遍的手段之一。目前主要术式包括：胃反流、混合反流、十二指肠反流和食管移植等。

1.2.1胃反流 王强等[7]应用5月龄新西兰大白兔先进行不洁饮食法和刺激法3周诱导胃排空障碍，3周后使用球囊扩张法破坏兔食管下括约肌，设计了一种同时具备食管下段抗反流屏障缺陷以及胃排空功能障碍的新型GERD动物模型。Silva等[8]标准化了手术诱导小鼠NERD的动物实验模型：在靠近幽门的十二指肠周围放置硅化无毒环，以促进幽门狭窄，限制胃排空(不完全阻断十二指肠腔)，并结扎胃底和胃体之间的过渡区，以限制胃的顺应性，术后通过观察炎症情况、食管黏膜的完整性、以及使用PPI的效果对模型进行评估，为NERD相关的病理生理机制研究提供了帮助。谢胜等[9]比较了贲门钢圈置入固定术(固定钢圈于鞘管上，沿食管将钢圈送于贲门处，再用鱼线缝合固定)和食管气囊扩张术两种建立大鼠反流模型的术式，两种术式均可成功建立大鼠GERD模型，但贲门钢圈置入固定术实验组的大鼠自第二周开始出现钢圈脱落，可能是固定线不耐腐蚀及缝合方式不佳所致，大鼠模型维持时间短，实用性差，实验术式有待进一步改进。

1.2.2混合反流 已知的混合反流模型有三种：食管-十二指肠吻合术(EDA)、食管-空肠吻合术(esophagus-jejunal anastomosis，EJA)和食管-空肠、胃-空肠吻合术(EJGJ)[10]。EDA模型是将食管下括约肌与十二指肠起始部(距幽门1 cm)之间进行端端吻合，保留迷走神经，使胃分泌物与十二指肠分泌物一起经吻合口反流入食管，EDA模型可以很好的模拟GERD患者的反流状态。然而，在EDA模型中，十二指肠液反流减少，难以诱发巴雷特食管[11]。EJA模型是在食管下段和空肠起始部之间进行端端吻合，并保留迷走神经，使所有来自胃和十二指肠的液体都可以流入食管下段。然而，在EJA模型中，反流太剧烈，不能模拟巴雷特食管患者由慢性胃食管反流诱发的真实情况。在EJGJ模型中，胃液从胃排入空肠，与十二指肠液混合流入食管下段，EJGJ模型综合了EDA和EJA模型模拟人类GERD的病理生理状态。

Theisen等[11]采用转基因大鼠通过食管十二指肠端侧吻合术诱导十二指肠分泌物向食管的外科分流，然后将每只转基因大鼠暴露在化学致癌物(如亚硝胺)或十二指肠胃反流中16周，成功构建了GERD的EDA动物模型，其中亚硝胺处理使乳糖操纵子调节基因(LacI)突变频率增加近20倍，出现的特异性突变明显高于偶然预期，并与人类食管腺癌p53突变中发现的相似，提示反流物与人类食管腺癌的发生可能有关。Kanai等[12]在进行宿主因素对巴雷特食管癌变的影响研究中，不切除胃而直接行EJA术式，构建了小鼠、大鼠胃十二指肠反流模型：剖腹后切断食管胃连接部，将残胃连续缝合，在食管断端和距幽门环约2 cm的空肠上端之间进行端侧吻合。张涛[13]等将75只大鼠随机分为实验组和对照组，将实验组大鼠食管下段切断，在距离幽门0.5 cm位置处切断十二指肠，并将十二指肠断端、食管断端自空肠起始处依次端-侧吻合至空肠壁上，成功建成EJGJ反流模型，模拟了GERD患者反流性食管炎-巴雷特食管-EAC的整个发展过程。此外，Wen等[10]将EJGJ模型进行了优化改进：延长胃空肠吻合口和食管空肠吻合口的距离，使胃液与十二指肠液能很好地混合，同时为避免梗阻，在食管下段将平行切口改为斜切口，增加了食管-空肠吻合口长度，以上两种改良方法提高了存活大鼠巴雷特食管的发生率，并有效降低大鼠因梗阻致死的术后并发症。

1.2.3十二指肠反流模型和食管移植模型 He等[14]和Arcidiacono等[15]在混合反流的基础上于食管胃连接部切断并结扎食管，幽门处切断并结扎十二指肠，进行空肠-食管端侧吻合，去掉整个胃，建立了十二指肠反流模型。王瑞华等[16]分别建立了大鼠EDA模型、EJA模型及十二指肠反流模型，术后观察大鼠的一般情况和食管病变情况，发现3种术式的模型组均出现程度不同的反流性食管炎，其中EJA模型组、EDA模型组食管病变较重，且巴雷特食管发生率均高于十二指肠反流模型组。王学伟等[17]采用5种不同术式建立大鼠食管胆汁反流模型，发现5种反流模型均能依次导致反流性食管炎-巴雷特食管-巴雷特食管上皮不典型增生和腺癌、或鳞癌和腺-鳞癌，提示反流性食管炎-巴雷特食管-食管腺癌的发生模式存在，且胆汁反流是病因之一。

巴雷特食管有发生腺癌的可能，表现为食管下段黏膜的鳞状上皮细胞被柱状上皮细胞所取代，是GERD的并发症。Watanabe等[18]采用8周龄大鼠为实验动物，分别将大鼠不同部位的正常黏膜组织移植到大鼠十二指肠中，观察移植到十二指肠部位的正常组织阿利新蓝PAS染色，结果发现移植到十二指肠部位的正常组织中均可见杯状细胞，呈绿色荧光蛋白(GFP)阳性，黏蛋白阳性，边缘有碱性磷酸酶活性，该实验结果表明组织内的干细胞具有多分化潜能，当移植到不同的部位时，可以转分化为该部位相应的器官组织。该实验中，移植到十二指肠壁上的大鼠前胃正常黏膜组织发生肠化生可能源于鳞状上皮细胞的转分化，食管移植实验对巴雷特食管起源的研究将提供新的途径[19]。

1.2.4其他与GERD有关的研究 Bahadr等[20]研究大鼠腹腔镜手术中腹内压(IAP)持续时间对GER的影响时得出结论，长时间的腹腔镜手术可能导致GER。该实验结果可为今后制备GERD动物模型时提供辅助方法和新思路。

外科模型无论采用何种术式，优点是建模效率高，接近GERD的解剖学发生机制，适用于病因和发病机制研究；但该类方法操作过程复杂，创伤大，改变了动物生理解剖结构，影响存活率，而且仅强调影响胃排空障碍的解剖学改变，无法模拟其他功能性因素对食管胃动力的改变。熟练的模型制备技巧对建模成功率至关重要，在制备过程中应注意：(1)实验动物术前禁食时长应大于24小时，保证胃排空，减少术后腹腔感染;(2)术中开腹后应保持消化道通畅，避免扭曲成角;(3)游离下段食管时避免损伤迷走神经;(4)注意缝合方式、缝合线种类及线头留用的长短，避免吻合口漏或严重出血;(5)为避免术后腹腔污染严重、增加实验动物死亡率，可于术前预防性使用抗生素[21]。

1.3 遗传模型

近年来通过基因改变制备GERD模型也开始受到关注，遗传模型多用于巴雷特食管和食管腺癌动物模型的建立。小鼠模型非常适合于分子基因研究，因为小鼠基因组已经完全测序，有许多学者尝试利用转基因和异种移植小鼠模型来研究巴雷特食管[2]。Hao等[22]对野生型p53A135V转基因小鼠和A/J株INK4a/Arf+/-小鼠进行反流手术，其中，一些小鼠还接受奥美拉唑(饮食中加入奥美拉唑的浓度为1400 ppm)、铁(50 mg/kg/m，注射或口服)或胃切除加铁的治疗，结果实验中没有一只小鼠患上食管腺癌，他们的研究认为手术诱导的胃食管反流可导致小鼠食管鳞状细胞癌，而不是食管腺癌。抑癌基因p53、p27和p16在人EAC中经常发生突变或丢失。p53-/-和p27-/-小鼠对手术诱导的巴雷特食管和EAC更敏感，p16-/-进行反流手术的小鼠只诱导了鳞状细胞癌，而不是EAC[19]。目前遗传模型的研究有限，仍需要更大范围的验证。

1.4 内镜干预模型

有研究[23]选用6头肉猪，采用经口内镜下隧道技术于齿状线上方5 cm处切开食管全层，术前、术后均行食管造影，观察造影剂通过食管下段时的阻力变化，结果发现食管下段在手术前后无明显缩窄或增宽，术后造影剂通过顺利，而食管下括约肌张力明显松弛，从而建立了一种微创、新颖的内镜下GERD大动物模型制备方法。Alshehri等[24]通过切开猪食管下括约肌制备GERD模型，并于内镜下注射右旋糖酐透明质酸共聚物(DxHA)于食管下括约肌，发现注射DxHA可引起成纤维细胞和巨细胞的异物反应，增强食管下括约肌的抗反流屏障功能，对GERD有潜在的治疗作用。

孙贤久等[25]选取健康6-12月龄的实验犬，通过内镜下切开环行肌的手术方法制备GERD模型，观察比较操作前后7天的食管压力、食管pH值测定及处死后光镜下食管组织病理改变，成功建立了反流模型。该实验建模成功率较高且不破坏实验动物的解剖结构，较好地还原了反流性食管炎的病理发生机制，可能成为未来研究内镜下抗反流治疗的新型动物模型制备方法。

2 模型评价

GERD的诊断方式多种，包括症状学诊断、胃镜检查[色素内镜、 放大内镜、 窄带成像(NBI)、共聚焦激光纤维内镜、i-scan 技术等新显像模式的特殊内镜]、食管pH监测(24 h食管pH监测、食管阻抗-pH监测以及无线食管 pH 胶囊监测)、质子泵抑制剂(PPI)诊断性试验、高分辨率食管测压、食管钡剂造影、胃肠超声造影、唾液胃蛋白酶原检测等[26]。受限于动物实验的独特性和局限性，目前GERD动物模型制备的检测方式多采用建模后病理观察食管黏膜病变，包括肉眼下、HE染色光镜下、电镜下等观察食管黏膜炎性病变，判断反流建模成功与否。借鉴GERD患者的诊断方式，可以将24 h食管pH监测、食管阻抗-pH监测以及高分辨率食管测压等技术应用于GERD动物模型制备的监测评价中，从而提高对动物模型评价的敏感性，减轻食管病理取材对动物的损伤，同时有助于提高建模成功后动物的生存时间和利用率。

3 理想动物模型

目前大多数GERD模型是通过人为实验操作建立的，Glover等[27]报道了一种可以表现出自然发生GERD症状的已知物种，该实验收集了8只活检组织病理诊断为GERD的狒狒进行了回顾性研究，分析已知危险因素对疾病发展的影响程度(如饮酒、高脂饮食等)，首次报道了GERD可以在任何非人类灵长类物种中自然发生，并指出狒狒在解剖学和生理学上与人类相似，可能是研究GERD的一种较理想的动物模型。所谓理想的动物模型[2]应符合三个基本标准：(1)与人的遗传具有相关性；(2)食管胃连接部的解剖学与人类相似性；(3)自然发生病理生理学导致的GERD。小鼠和人类食管之间的组织学差异是这些手术模型的固有局限性。如果用于研究巴雷特食管和食管腺癌，可能需要将反流手术和基因改造或添加外源性致癌物结合起来，以提高建模成功率。

4 结论

现有GERD动物模型制备方式有不同程度的食管病变形成，但任何一种模型都具有内在的局限性，需要熟练掌握模型操作技术，提高建模成功率，降低动物术后死亡率并有效降低成本，同时选择更可靠的模型评估手段如pH监测等方式进行验证。根据实验目的选择合适的制备模型方法并提高模型质量，开发更简便、经济、有效的造模方法将是今后GERD动物模型研究的主要方向。