液质联用方法用于多发性硬化的血浆蛋白质组标志物研究

杨雯棋，吴绍长，周大金，章丽娟，闫秀梅，何成彦，何 平，孙景春*，赵龙友

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033；2.浙江省丽水市第二人民医院 a.老年医学科； b.检验科；c.临床实验室，浙江 丽水323000)

多发性硬化(MS)是一种免疫介导性的中枢神经系统疾病(CNS),以炎症反应、脱髓鞘、突触病变、少突胶质细胞丧失和反应性神经胶质细胞增生等为主要病理特征[1]。MS目前的发病机制是动态且复杂的。在同一MS亚型中，也能观察到不同的疾病进展情况[2]。并且，由于目前缺乏特异性早期诊断指标，许多患者无法在早期进行诊断，延误了疾病的治疗。为了早期识别疾病和提供更具体化的治疗方法，需要寻找有助于疾病早期诊断的生物标志物。蛋白质组学分析能够找到疾病相关差异蛋白，通过蛋白质功能分析可以阐明疾病机理，能为MS提示重要的相关通路，同时也可以发现用于MS诊断的生物标记物[3]。在目前的研究中，对体液中MS生物标志物的研究已有一些蛋白质组学相关结果。Maria L等人使用蛋白质组学技术在脑脊液中鉴定了8个MS亚型相关蛋白，其中载脂蛋白C-I、载脂蛋白A-II、augurin、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶和胰蛋白酶-1均上调[4]。Jesse H等人通过蛋白质组方法分析研究了MS的脑脊液，寻找相关蛋白质生物标记物，确定了一些潜在的生物标记物，可以用于区分多发性硬化症与健康对照和其他神经疾病，但还需要进一步的研究来验证其临床应用的能力[5]。并且，目前MS生物标志物的发现主要集中在脑脊液上，血浆蛋白质组的研究还有待于进一步加强。在过去的几年里，色谱质谱技术(LC-MS)、蛋白质组学方法学和生物信息学在医学领域的重大进展，广泛应用于中枢神经系统疾病的研究。因此，本研究使用高灵敏度的蛋白质组学分析技术来研究MS血浆蛋白质组，用于寻找相关的蛋白质诊断标记物。

1 材料与方法

1.1 标本收集

实验组患者符合 McDonald的 MS确诊标准，对照组系健康志愿者，经患者(家属)和健康志愿者知情同意后,静脉抽全血3 ml置于无菌的玻璃试管,静置 30 min后,高速低温离心 15 min,收集上清液,-80℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂与仪器

二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、尿素、硫脲、盐酸胍(Sigma-Aldrich 公司);胰蛋白酶(质谱级)(Promega 公司);乙腈、甲酸、乙醇、碳酸氢铵均为色谱级(Merk 公司);去除蛋白试剂盒、液相色谱、质谱仪(Thermo公司)

1.3 方法

1.3.1血浆蛋白的提取和酶切 去除血浆中高丰度蛋白，根据去除蛋白试剂盒(Thermo公司)说明书操作。应用BCA试剂盒对去除高丰度后的蛋白进行定量。取50 μg待测样品用(8 mol盐酸胍，50 mmolPBS)溶液变性。加入1 mol的DTT溶液，37℃静置1小时。加入1 mol的碘乙酰胺溶液。30℃，避光30 min。样本转移到 10 kd超滤膜上用缓冲液(7 mol/L尿素和50 mmol/L Tris) 清洗两次之后，用100 mM三乙基碳酸氢铵溶液再清洗两次。处理后的样品在100 mM三乙基碳酸氢铵溶液中用胰蛋白酶消化，37℃过夜。将超滤管4℃ 12 000×g/min 离心20 min，收集酶解产物。混匀样品肽段保存于-20℃冰箱。

1.3.2TMT定量标记 样品加入200 μl 超纯水、20 μl TMT 标记试剂，离心后室温静置1 h。加入4 μl 5%羟胺，终止反应15 min。真空抽干样品后冷冻保存待用。

1.3.3色谱-质谱(LC-MS)分析 多肽样品采用C18反相分析柱(50 mm×15 cm×3 μm)进行分离，液相的洗脱液梯度为 2%-100% B液(0.1%甲酸，80%乙腈)，洗脱时间为120 min。分析采用数据依赖性扫描模式，在Top20个母离子通过高能量碰撞(HCD)打碎，标准化(NCE)为30。子离子分辨率3500(AGC 2.2e4)。全扫描和MS/MS最大填充时间分别设置为50 ms和45 ms，动态排除时间设置为30 s。

1.4 统计学分析

1.4.1定性分析 利用Proteome Discovery 2.1软件进行数据库检索。

1.4.2生物信息学分析 用SIMCA软件对蛋白进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，用 IPA(Ingenuity Pathway Analysis)软件对差异蛋白进行通路富集分析。

2 结果

2.1 血浆蛋白质组的分析

在MS疾病组和健康对照组共18个血浆样品中鉴定出541种蛋白质，将两组共同定量到的229个蛋白质做 PCA分析，PCA结果表明MS疾病组(p)和健康对照组(c)之间的血浆蛋白质组表现出明显的分离趋势(图1)。

图1 血浆蛋白质组主成分分析 图2 血浆差异蛋白火山图

对MS疾病组和对照组进行血浆差异蛋白分析。根据P<0.05为筛选标准，得到差异蛋白质52个，其中27个为上调蛋白，25 个为下调蛋白(图2)。

2.2 血浆差异蛋白的生物信息学分析

IPA功能分析表明，MS相关的差异蛋白参与免疫应答、炎症反应、细胞间的信号传导/相互作用和中枢神经系统疾病发展等功能(图3)。传导通路分析表明，这些蛋白主要富集于免疫/炎症途径(原发性免疫缺陷信号、急性期反应信号、补体系统、B细胞信号通路、巨噬细胞信号通路、炎症反应、LXR/RXR激活、FXR/RXR激活、吞噬作用等)、凝血相关途径(凝血系统、内在凝血酶原激活途径、外在凝血酶原激活途径、动脉粥样硬化信号通路)(图4)。

图3 血浆差异蛋白功能分析 图4 血浆差异蛋白途径分析

2.3 血浆差异蛋白的受试者工作特征(ROC)分析通过ROC分析MS疾病组与健康对照组差异蛋白的关系，共找到17个蛋白(表1)的AUC。曲线下面积超过0.9，这些蛋白有可能成为MS诊断的血浆蛋白标志物。

表1 MS疾病组和健康对照组17个差异蛋白

3 讨论

本研究通过液质联用方法分析了血浆蛋白质组，共发现了57个MS诊断相关的差异蛋白，这些差异蛋白主要富集于免疫与炎症相关通路(补体系统、巨噬细胞信号通路、原发性免疫缺陷信号通路、B细胞信号通路、星形胶质细胞发展、LXR/RXR激活、急性期反应信号、FXR/RXR激活等)。其中，补体系统在整个生命过程中可调节中枢神经系统(CNS)的发育、稳态和再生。补体通路的过度激活可导致许多神经炎症疾病的发生，如视神经脊髓炎(NMO)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)等。最近的一项研究表明，补体沉积在MS大脑的突触上，并且在MS的动物模型(EAE)中，抑制补体级联可以防止突触丧失[6]。其次，巨噬细胞和星型胶质细胞是多发性硬化病理变化最突出的先天贡献者，主要负责髓鞘的损伤和清除，这是多发性硬化病变的标志[7]。此外，差异蛋白也参与凝血相关通路(凝血系统、动脉粥样硬化信号、内在凝血酶原激活、外在凝血酶原通路)。有研究表明血浆凝血系统对MS疾病进展的严重程度有重要贡献[8]。在多发性硬化症患者中，几种凝血因子的失调均被证实，如F12、F1等[9]，提示凝血可能是MS的重要功能途径之一。

通过去差异蛋白进行ROC分析，找到了17种具有临床应用潜力的蛋白，其中胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP-2)和肝细胞生长因子(HGF)具有良好的应用潜力。

IGFBP-2的主要功能是将IGF-1转运到特定的组织和细胞中，IGF-1不仅是一种有效的神经营养保护因子，而且是一种少突胶质细胞的生长因子，具有强大的髓鞘生成能力。以往研究表明，MS中IGFBP-2的上调可能会将IGF-1靶向到反应性星形胶质细胞中，引发反应性星形胶质细胞产生少突胶质细胞支持因子或提供一个有利的结构环境，从而辅助多发性硬化的自发再髓鞘发生[10]。本研究通过差异蛋白功能分析发现IGFBP-2参与的胰岛素样生长因子(IGF-1)信号通路得到富集，说明IGFBP-2可以反映MS疾病的变化，有可能成为MS潜在的血浆标志物。

HGF是中枢神经系统中一种多功能蛋白，具有重要的神经营养功能。在以往的研究显示，HGF与MS疾病相关。在神经元特异性过表达HGF的转基因EAE小鼠或接受外源性HGF供应的EAE小鼠中，神经炎症和脱髓鞘的严重程度显著降低[11]。本研究中发现HGF水平升高，这可能是MS疾病相关炎症导致的神经元损伤，从而导致的机体的一种代偿效应。同时，本研究发现，HGF参与的调控通路白细胞介素-7、上皮细胞的重塑连接、巨噬细胞的信号通路等均得到了富集，与以往的研究相一致，说明HGF在MS发病过程中有重要作用，其可能是治疗MS疾病的一个潜在的靶点和诊断标志物。

总之，本研究利用液质联用技术，研究了多发性硬化患者组和健康对照组的血浆蛋白质组。发现了一些有可能用于区分MS疾病组和健康对照组的血浆标志物，这为MS的早期诊断提供了线索，为未来MS疾病的研究奠定了基础。