CRMP2衍生的TAT-CBD3多肽对阿尔茨海默病神经元的保护作用

姚 远,任晶红,刘环宇,纪影实

(吉林大学基础医学院 药理学系，吉林 长春130021)

阿尔茨海默病(AD)的发病机制非常复杂，目前尚不清楚[1]。研究发现，脑衰反应调节蛋白2(CRMP2)与AD的发生关系密切。在AD大鼠的海马和皮层组织中，磷酸化的CRMP2表达增加[2]。磷酸化的CRMP2与N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDARs)结合，引起NMDARs的过度激活，导致胞内钙超载，进而触发下游级联反应，引起细胞功能紊乱[3]。研究证实，干扰CRMP2与NMDARs的相互作用，具有神经保护作用。CRMP2通过钙通道结合域3(CBD3)与NMDARs结合,然而，CBD3多肽的通透性不佳，难以进入细胞内，影响药效，通过HIV的穿膜肽TAT与CBD3多肽连接融合即TAT-CBD3多肽，其穿膜能力明显增强。本研究观察CRMP2衍生的TAT-CBD3多肽对AD大鼠神经元的保护作用并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器Aβ25-35购于美国Sigma-Aldrich公司，TAT-CBD3由上海耀强生物科技有限公司生产，纯度为99%，CRMP2抗体、NMDAR2B抗体、GAPDH抗体、pCRMP2(Ser522)抗体购于Abcam公司，羊抗兔二抗、兔IgG、Protein A+G Agarose购于碧云天生物技术公司，脑立体定位仪由美国Stoelting公司生产，DMS-2 型Morris 水迷宫系统由中国医学科学院药物研究所生产。

1.2 实验动物分组雄性Wistar大鼠40只，体重280-310 g，购自吉林大学实验动物研究中心，合格证号为SCXK(吉)2017-0001。大鼠自由进食水2周后，随机分为4组，每组10只，分别为假手术组(Sham)，模型组(Model)，TAT-CBD3低剂量组(TAT-CBD3-L)，TAT-CBD3高剂量组(TAT-CBD3-H)。ST2-104低剂量组给药剂量为3 mg/kg，ST2-104高剂量组给药剂量为10 mg/kg，经尾静脉注射，连续给药15 d。模型组及假手术组给予等量的生理盐水。

1.3 AD模型的建立Wistar大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)，俯卧位固定于脑立体定位仪上。常规去毛、消毒后，在头顶切开2-3 cm切口，分离骨膜。侧脑室定位：以前囟点为原点，旁开1.8 mm，后开1.08 mm，深3.8 mm。用牙科钻头打孔，小心刺破脑膜，用微量移液器注射0.8 μl预先配备的凝聚态Aβ25-35，全部溶液在15 min内注射完成。注射结束后，留针10 min。术后清理伤口，缝合皮肤。假手术组大鼠注射等量的生理盐水。

1.4 认知功能评价采用Morris水迷宫对给药15 d后大鼠的认知功能进行评价。将水迷宫放置在黑暗隔音的房间中，水深20 cm，温度控制在22℃，平台置于第3象限，低于水面2 cm，整个实验过程中平台位置保持不变。给药第9 d开始进行定位航行训练，训练时间均为5 d，以4个不同象限为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，实时摄像监测大鼠到达水下平台的时间(逃避潜伏期)，超过120 s 仍未找到则将大鼠引导至平台，停留10 s 后移出。定位航行实验检测结束后，撤去平台，进行大鼠空间搜索检测，观察并记录2 min内大鼠穿越原平台所在位置的次数和在原平台停留时间，检测大鼠空间定位能力，多次测量取平均值。

1.5 Western Blot检测蛋白表达大鼠用乌拉坦麻醉，断头处死，冰上取出大鼠海马组织，提取蛋白，BCA蛋白定量。蛋白上样量为30 μg，先恒压80 V，30 min，待样品至分离胶时，调整电压至120 V 持续90 min，蛋白分离后，转移至PVDF膜，电流调至150 mA，用时2 h。加入5%脱脂奶粉，置摇床封闭2 h，加入按不同比例稀释的一抗抗体CRMP2(1∶500)，pCRMP2(1∶1000)，NMDAR2B(1∶1000)，4 ℃过夜；1×TBST洗膜3 次，每次10 min；加入二抗(1∶2000)，室温孵育2 h；1×TBST 洗膜3 次，每次10 min；ECL 底物液显色。采用Quantity One 分析软件计算条带灰度值，目的条带灰度值/内参条带灰度值即为目的蛋白相对表达水平。

1.6 HE染色取大鼠海马组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。二甲苯Ⅰ脱蜡10 min，二甲苯Ⅱ脱蜡10 min，梯度乙醇脱水。苏木精染色液10 min，冲洗，自来水反蓝10 min，蒸馏水洗涤5 s，95%乙醇5 s，伊红染色液10 s，梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各5 min，中性树胶封片，显微镜下观察海马CA1区的病理学形态变化。

1.7 免疫共沉淀检测蛋白相互作用用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取大鼠海马组织蛋白，取1 mg样品蛋白，加入用于相应免疫沉淀的一抗，阴性对照加入1 μg兔来源IgG，4℃缓慢摇动过夜。再加入20 μl充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动2 h。4℃12000 rpm/min离心1 min，轻轻弃去上清。PBS清洗2次，12000 rpm/min离心1 min，弃去上清。加入20 μl SDS-PAG缓冲液，涡旋重悬沉淀。沸水浴5 min，以游离抗原、抗体、Agarose，1000 g离心5 min，取上清，SDS-PAGE 凝胶电泳，进行Western blot 检测。

2 结果

2.1 TAT-CBD3多肽对阿尔兹海默病大鼠认知能力的影响

Morris 水迷宫检测结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠运动轨迹杂乱无章、无目的性，逃避潜伏期时间明显延长，差异具有显著性(P<0.001)；与模型组比较，TAT-CBD3组大鼠逃避潜伏期时间明显缩短(P<0.05，P<0.01)。大鼠空间定位搜索检测结果显示，与假手术比较，模型组大鼠在2 min内穿越原平台象限时间(1.78±0.21 s)、跨越原平台象限有效次数(3.21±0.45)均显著降低(P<0.001，P<0.01)；与模型组比较，TAT-CBD3组大鼠在水池中定向轨迹运动更强，更加具有目的性，穿越原平台时间和次数明显增加(P<0.05，P<0.01)。水迷宫实验表明，TAT-CBD3多肽可以有效的改善大鼠的学习和记忆能力，此作用在较低的浓度下即可发挥。

表1 TAT-CBD3对大鼠行为学的影响

2.2 TAT-CBD3多肽对阿尔兹海默病大鼠海马神经元的影响

大鼠海马组织HE染色结果显示，与假手术组比较，模型组海马CA1区正常神经元数量明显减少，细胞排列紊乱，结构不清晰，出现坏死脱落，变形，核固缩碎裂现象。TAT-CBD3多肽治疗后，细胞排列趋于整齐，正常神经元数目明显增多。表明TAT-CBD3多肽对AD损伤神经元具有一定的保护作用。结果见图1。

2.3 TAT-CBD3多肽对AD大鼠海马组织NMDAR2B、CRMP2、pCRMP2蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，假手术组CRMP2蛋白表达量较多，pCRMP2蛋白磷酸化程度维持在较低水平；与假手术组比较，模型组AD大鼠脑组织pCRMP2蛋白表达明显升高(P<0.001)，相应的总CRMP2蛋白表达降低；与模型组比较，TAT-CBD3高剂量组pCRMP2蛋白表达明显减低(P<0.05)。另外，与假手术组比较，模型组NMDAR2B蛋白表达明显增加(P<0.001)；与模型组比较，TAT-CBD3高剂量组NMDAR2B蛋白表达明显降低(P<0.05)。说明TAT-CBD3可以抑制AD大鼠海马组织中NMDAR2B蛋白表达，并抑制CRMP2蛋白磷酸化。结果见图2。

图2 TAT-CBD3多肽对NMDAR2B、CRMP2、pCRMP2蛋白表达的影响

2.4 TAT-CBD3多肽对AD大鼠海马组织中pCRMP2、NMDAR2B蛋白相互作用的影响

用常规IgG沉淀，没有出现pCRMP2条带，说明该免疫共沉淀实验具有特异性；用NMDAR2B单克隆抗体沉淀pCRMP2/NMDAR2B复合体，显示出pCRMP2条带。与对照组比较，模型组沉淀的pCRMP2显著增多(P<0.01)；与模型组比较，TAT-CBD3-H多肽组沉淀的pCRMP2显著减少(P<0.01)。说明TAT-CBD3可以干扰pCRMP2与NMDAR2B蛋白的相互作用。结果见图3。

图3 TAT-CBD3对pCRMP2、NMDAR2B蛋白相互作用的影响

3 讨论

当前临床上用于治疗AD的药物，疗效并不十分理想[4]。小分子多肽尤其是从内源性蛋白衍生的多肽因其与靶向蛋白具有同源结合位点，与靶蛋白亲和力更高、靶向性更强，是当前研究的热点[5]。本实验研究结果表明，AD模型大鼠记忆力明显减退，海马CA1区神经元排列紊乱，细胞结构完整性受到破坏，TAT-CBD3多肽治疗后大鼠记忆功能明显改善，海马神经元损伤明显减轻，表明TAT-CBD3多肽对于阿尔茨海默病具有治疗作用。

AD的发病机制非常复杂，研究认为，谷氨酸兴奋性损伤是AD发生的重要机制之一。谷氨酸在中枢神经系统的作用非常广泛，可以介导Mg2+、Ca2+等离子的内流，参与神经突触的可塑性调节，与学习记忆密切相关[6-7]。谷氨酸的作用是由谷氨酸受体介导的，NMDA受体有NMDAR1、NMDAR2等亚型，研究认为NMDAR2B与AD关系更为密切。研究发现，NMDA受体过度激活可导致钙内流增加，引起钙超载，进而引发下游级联反应，引起神经系统多种疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病和癫痫等[8]。研究显示，NMDARs拮抗剂在脑缺血再灌注损伤和脑外伤中具有神经保护作用。目前，临床上用于中、重度AD治疗的美金刚即是非竞争性NMDARs拮抗剂[9]。由此可见，NMDARs的过度激活对AD的发病具有关键的作用，NMDARs可能成为AD治疗的潜在靶点，抑制NMDAR的功能可能对于AD具有治疗作用。本研究表明，AD大鼠海马组织中NMDAR2B表达明显增加，而TAT-CBD3多肽可明显降低NMDAR2B蛋白表达，从而抑制其功能，减轻细胞内钙超载。

CRMP2是NMDARs的分子伴侣，两者通过相互作用调节突触前膜的钙离子电流。CRMP2在AD的发病中起到重要作用[10]，研究发现，AD大鼠脑内CRMP2磷酸化水平明显增加。CRMP2是CRMPs蛋白家族的五种亚型之一，在海马神经元表达非常丰富。CRMP2即可介导生理效应，又可引起病理反应[11]。研究显示，CRMP2通过CBD3与NMDAR结合，磷酸化的CRMP2与NMDAR结合后，可使后者活化，介导钙离子内流增加。通过药物干预或基因敲除CRMP2抑制CRMP2与NMDAR相互作用，可以抑制钙离子内流，起到细胞保护作用。本研究结果表明，给予TAT-CBD3多肽治疗后，CRMP2磷酸化水平明显降低，pCRMP2与NMDAR2B两种蛋白之间的相互作用受到抑制[12-13]。

综上所述，TAT-CBD3多肽对于阿尔茨海默病具有治疗作用，抑制神经元损伤，其机制可能与其降低脑组织中CRMP2蛋白磷酸化，抑制pCRMP2 与NMDAR 2B的相互作用，抑制细胞钙超载有关。