EIF5A2和MMP-21在胰腺导管腺癌中的表达及意义

崔念磊,薛 磊,苏冬月,韩家凯,李丹丹

(1.濮阳惠民医院 外二科,河南 濮阳457000；2.河南大学淮河医院 内分泌科,河南 开封475000)

胰腺导管腺癌是胰腺最常见的肿瘤，多发生于中老年人。肿瘤的形成与胰腺导管上皮细胞异型增生有关。病变进展过程中可见多种蛋白的表达失调[1]。真核翻译起始因子5A2(EIF5A2)是一种能激活聚尿苷mRNA翻译的哺乳动物蛋白，与上皮细胞的恶性转化有关，是基因调控通路中的重要成员，对启动下游基因诱导的增殖有重要价值[2]。基质金属蛋白酶-21(MMP-21)是MMPs家族中新发现的成员，对细胞外基质的降解作用较强，可引起肿瘤细胞周围的间质重塑，使可溶性细胞因子分泌增多，加速肿瘤细胞的迁移。也有研究认为MMP-21在细胞外基质的活化和癌性间质的形成中有重要作用[3]。本研究观察胰腺导管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA的表达，分析其临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床标本及细胞株

选择2013.01-2014.12期间在濮阳惠民医院确诊并行手术治疗的79例胰腺导管腺癌患者作为研究对象。纳入标准：①符合WHO中的病理诊断标准；②临床随访资料完整。排除标准：①伴有其他器官恶性肿瘤；②Lynch综合征；③术前行放、化疗者；④患者或家属不同意观察者。年龄42-87岁，中位年龄58岁，其中男性41例，女性38例。留取肿瘤组织作为观察组，留取距肿物边缘大于3 cm的正常胰腺组织(经病理证实)作为对照组，均留取新鲜组织(-80℃冰箱中冻存)和石蜡包埋组织。研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签定知情同意书。选择人胰腺癌细胞株PANC-1，购自中国科学院典型培养物保藏细胞库。

1.2 样本量评估

按EIF5A2在预实验中表达的阳性结果估计样本量，采用两样本率比较的评估方法：即n1=n2=[(uα+uβ)/δ]2[π1(1-π1)+π2(1-π2)]，拟定对照组表达阳性率约10%，肿瘤中表达的阳性率约50%，差值40%，α取双侧0.05，计算n1=n2≈79例。

1.3 实验方法

1.3.1免疫组化法 应用免疫组化SP法检测EIF5A2和MMP-21蛋白的表达。试剂均为浓缩液，购自武汉博士德生物技术公司。先行预实验，选取显色效果最理想的浓度(EIF5A2为1∶300、MMP-21为1∶250)进行正式实验，DAB显色，严格按实验步骤操作，均由同一检验师操作，设阳性和阴性对照。

结果判断：阳性部位均是细胞质，以二维角度进行评价。以无、浅黄、黄、黄褐色分别计为0、1、2、3分。选择5个显微镜(400倍)视野，以<5%为0分，5%-10%为1分，以11%-30%为2分，以31%-50%为3分，以>50%为4分。评分相加，总分为0-7分，以≤3分阴性，以>3分阳性。

1.3.2实时荧光定量PCR法(qPCR) 应用实时荧光定量PCR法检测EIF5A2和MMP-21 mRNA的表达。严格按实验步骤进行操作。引物见表1。应用mRNA模板，该反应体系的体积总计为30 μl。扩增程序： 95℃ 8 min，1个循环；95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，10个循环；93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，21个循环。于60℃时采集荧光信号，读取Ct值。操作严格按实验步骤完成，并设阳性对照和阴性对照，做好质控工作。结果以S型曲线表示，以Ct值≤30为阳性，Ct值为Undet或>30为阴性。

表1 引物设计

1.3.3细胞培养 人胰腺癌细胞应用10%FBS的RPMI-1640培养基，在37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养。3天传1代。在细胞对数生长期时收集细胞计数、进行实验。应用Lip2000转染试剂盒进行操作。稀释Lip2000、EIF5A2 siRNA和Control siRNA，将稀释后的Lip2000与siRNA混匀，孵育20 min。取生长至对数期的细胞，以每孔5×105个接种于6孔板，细胞达50%生长融合度时，将Lip2000 siRNA形成的复合物加入到细胞培养板中，混合后继续培养24 h。建立空白对照组、空载体组和EIF5A2 siRNA组，应用Western Blot检测MMP-21的表达。

1.4 统计分析

应用SAS6.12软件进行统计分析，定量资料应用 均数±标准差 表示，两组间比较行配对资料的t检验或独立样本的t检验，率的比较行卡方检验，应用Spearman相关分析和K-M生存分析，以P<0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1两组中EIF5A2和MMP-21阳性率的比较 两组中EIF5A2和MMP-21阳性率差别有统计学意义。见表2、图1。

图1 EIF5A2和MMP-21的表达(IHC ×200)

表2 两组中EIF5A2和MMP-21阳性率的比较(%)

2.1.2EIF5A2和MMP-21在不同临床特征中表达的比较 EIF5A2和MMP-21的表达在不同增殖指数、脉管侵犯和K-ras基因突变的分组中差别有统计学意义。EIF5A2的表达在有无神经侵犯的分组中差别有统计学意义。MMP-21的表达在有无淋巴结转移的分组中差别有统计学意义。见表3、图2、3。

表3 EIF5A2和MMP-21在不同临床特征中表达的比较(%)

图2 淋巴结转移(HE ×200)

图3 Ki67的表达(IHC ×200)

2.1.3EIF5A2和MMP-21的相关性 应用Spearman相关分析，显示EIF5A2和MMP-21呈正相关性(r=0.69，P=0.037)。见图4。

图4 EIF5A2和MMP-21的相关性

2.1.4EIF5A2和MMP-21与生存时间的关系 患者均进行术后5年生存时间的随访。截止时间为2019.12.31。其中存活10例，死亡64例，失访5例。死亡患者术后生存时间为4-60个月。应用K-M生存分析显示EIF5A2(χ2=5.36，P=0.025)和MMP-21(χ2=5.97，P=0.011)的表达与生存时间相关，即EIF5A2和MMP-21高表达患者的预后差。见图5。

图5 EIF5A2和MMP-21与生存时间的关系

2.2 两组中EIF5A2和MMP-21的mRNA表达的比较

两组中EIF5A2和MMP-21的mRNA表达阳性率差别有统计学意义。见表4、图6。

图6 EIF5A2和MMP-21的mRNA表达(qPCR法)

表4 两组中EIF5A2和MMP-21的mRNA表达的比较(%)

2.3 细胞培养实验中各组MMP-21的表达

相对于空白对照组和空载体组，EIF5A2 siRNA组中MMP-21的表达下降，提示EIF5A2 低表达可以引起MMP21的表达下调。见表5。

表5 细胞培养实验中各组MMP-21的表达

3 讨论

胰腺导管腺癌生长较快，由于部位的特殊性，发现较为困难，肿瘤体积常较大，边界不清楚，并伴有明显的出血和坏死。病理特征表现为明显的异型腺管，间质伴显著的纤维化[4]。病变在形成和进展中与肿瘤的生长和侵袭有关。研究认为增殖、转移和翻译的相关蛋白均与病变的形成直接相关[5]。EIF5A2是在卵巢癌UACC-1598细胞中分离出来的基因，被TIF51B基因所编码，在代谢和翻译延长方面有重要作用。EIF5A2作为EIF家族中具有高度保守序列的基因，对肿瘤细胞生长和增殖、翻译及mRNA转化有一定作用。也有研究认为EIF5A2与细胞凋亡相关[6]。陈杰伟等[7]通过观察EIF5A2在食管癌中的表达，发现EIF5A2在肿瘤中高表达，认为其参与了肿瘤的形成，并促进肿瘤的侵袭过程。在肿瘤发生侵袭和转移前，上皮和间质可以出现转化，即由分化和未分化二种状态间的互相转化，这使上皮细胞失去了上皮的特征，如黏附性和极性，并使肿瘤外围的细胞获得部分间质细胞的特性，其功能和结构也发生改变，并具有较高的侵袭能力和抗凋亡作用，使细胞骨架出现反转性重构，细胞具有较强的迁移特征。而EIF5A2在肿瘤进展时具有这种转化的促进作用，并在部分肿瘤中已经证实，如肝癌[8]、胃癌[9]等。在间质转化过程中，与间质相关的因子可能伴有协同作用，如MMPs家族的相关成员。MMP-21是MMPs家族中的重要成员，编码七个外显子，广泛表达于人类恶性肿瘤中，是重要的基质水解酶，其对降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白、层黏连蛋白的作用最强[10-11]。也有研究认为MMP-21能使表皮生长因子的功能更完善，对细胞黏附的调节作用更强，肿瘤细胞具有更强的局部侵袭特征和远隔器官播散的作用[12]。

研究显示胰腺导管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA的表达均明显升高，提示EIF5A2和MMP-21的蛋白表达与mRNA的表达水平具有高度的一致性，提示二者是肿瘤形成的重要促进蛋白。EIF5A2对mRNA转录、翻译有重要的促进功能，并能调控核质运输，对细胞质的翻译作用突出。EIF5A2是肿瘤细胞合成中蛋白合成的调控因子，可以引起细胞增殖和转移的异型转化，EIF5A2在发挥功能时也常受很多因素的影响，如缺氧、血管生成等[2]。EIF5A2还能通过多种机制诱导上皮和间质转化，进而对胰腺癌的形成和进展起重要促进作用。结果显示EIF5A2和MMP-21的表达与增殖指数和脉管侵犯密切相关，提示EIF5A2和MMP-21高表达时可以引起肿瘤细胞繁殖加快，细胞生长旺盛，细胞数量增加，肿瘤体积增大，同时可以引起局灶脉管的侵袭，使肿瘤细胞进入脉管，为转移提供重要途径。结果显示EIF5A2和MMP-21的表达与有无K-ras基因突变相关，提示可能参与K-ras介导的机体细胞的异型增生，二者也可能与K-ras对抗的肿瘤治疗相关。本研究显示EIF5A2的表达与神经侵犯密切相关，提示EIF5A2是嗜神经生长的因子之一，EIF5A2也可能是神经细胞的黏附相关蛋白，在对转移性黏附的调节过程中起一定作用。结果显示MMP-21与淋巴结转移有关，提示MMP-21高表达可能促进肿瘤的淋巴道播散，这与MMPs家族中相关成员的经典功能较为一致，但是由于MMP-21降解的间质成分较其他成员更多，因此MMP-21可能是家族中促进转移作用最强的。结果显示EIF5A2和MMP-21的表达与生存时间相关，提示检测二者的表达对预测患者的预后有一定价值。EIF5A2和MMP-21具有的正相关性，在胰腺癌细胞中观察到EIF5A2 siNRA组中MMP-21表达下调，也验证了二者具有可能的靶向调控关系。EIF5A2可能是上游基因，对MMP-21产生起一定的调控作用。EIF5A2在肿瘤中分泌增多，引起MMP-21高表达，调节肿瘤细胞发生迁移[13]。此时包括MMP-21的MMPs家族中的多种成员的表达均升高，降解基底膜等肿瘤转移的屏障，为肿瘤迁移提供了更直接的通路，诱导转移的发生[14-15]。EIF5A2在病变进展时使微管蛋白的组装发生变化，使肿瘤细胞的稳定性发生改变[16]。此种作用的机制与EIF5A2激活聚尿苷mRNA的翻译功能可能有关。也有观点认为MicroRNAs的相关因子与EIF5A2具有结合位点，通过靶向EIF5A2调控肿瘤的进展[17]，其作用涉及肿瘤细胞增殖、凋亡及迁移等机制[18]。但是关于EIF5A2和MMP-21对肿瘤进展的作用及调控通路有待更多基础实验来明确[19-20]。

总之，胰腺导管腺癌中EIF5A2和MMP-21蛋白和mRNA高表达，对病变的形成和进展有明显作用，二者可能具有协同正向作用，联合检测二者的表达对判断预后可能有一定作用。