基于网络药理学的逍遥丸治疗高泌乳素血症潜在作用机制研究

江益娟 谢海燕

高泌乳素血症是精神疾病患者药物治疗过程中最常见的不良反应之一，可能与性腺机能减退、生殖功能障碍和骨质流失有关，其机制主要是抗精神病药与泌乳素细胞膜上的D2 受体结合后，阻断多巴胺对泌乳素合成与释放的抑制效应，使泌乳素的合成与释放脱抑制，从而导致血清泌乳素水平升高[1]。目前临床的干预措施主要有换药，联合使用小剂量的阿立哌唑、溴隐亭等多巴受体激动药[2]，但多巴胺受体激动剂与抗精神病药物的作用机制刚好相反，可导致精神症状波动，因此在精神分裂症患者的使用时需密切关注其精神症状。逍遥丸出自宋朝《太平惠民和剂局方》，研究证实，逍遥丸能有效降低女性精神分裂症患者服用抗精神病药所致的血清高泌乳素水平，且不会影响患者病情的稳定，但由于其组方成分复杂，限制了其使用范围[3-4]。本研究采用网络药理学方法[5]，通过数据挖掘和分析，筛选并预测逍遥丸活性成分治疗HPRL 的潜在靶点和信号通路，以期为高泌乳素血症的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据库、软件与分析工具 本研究使用的数据库、软件及分析工具见表1。

表1 数据库及软件

1.2 研究方法

1.2.1 逍遥丸组分中7 味中药的活性成分收集和筛选 通过TCMSP 检索逍遥丸中柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草和薄荷7 味中药的相关化学成分的ADME[6-7]参数，利用口服生物利用度（OB）≥30%与类药性（DL）≥0.18 作为筛选标准[8]，进行初步筛选。

1.2.2 逍遥丸作用靶点预测 从TCMSP 靶点预测模型预测逍遥丸组分中7 味中药活性成分的作用靶点，并利用UniProt 数据库将靶蛋白转换成对应的靶基因。

1.2.3 筛选高泌乳素血症作用靶点 以“Hyperprolactinemia”为关键词，通过筛选GeneCards、OMIM、PharmGKB 数据库中搜寻获得高泌素血症的相关靶点，运用R ×64 3.5.3 软件将高泌乳素血症的相关靶点与逍遥丸作用的基因靶点进行匹配，绘制韦恩图（VennDiagram）。

1.2.4 逍遥丸成分-靶点-高泌乳素血症网络构建将从逍遥丸中得到的上述候选化合物、靶点、高泌乳素血症作为节点，利用Cytoscape 3.7.1 软件构建相互作用调控网络模型。

1.2.5 蛋白-蛋白相互作用分析（即PPI 网络分析）将交集得到的基因导入STRING 平台构建蛋白质相互作用网络，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为“low connfidence”，其他参数保持默认值，得到逍遥丸治疗高泌乳素血症的体内反应网络。

1.2.6 基因富集分析 采用DAVID 数据库对逍遥丸治疗高泌乳素血症的靶点基因进行基因功能（GO）富集分析，通过R ×64 3.5.3 软件安装“Dose”“color-space”“stringi”对其进行通路注释（KEGG）富集分析，对富集分析结果进行可视化分析，明确其治疗高泌乳素血症的主要药理学机制。

2 结果

2.1 逍遥丸组分中7 味中药化学成分筛选 通过TCMSP 数据库分别搜寻到逍遥丸中的柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草、薄荷7 味中药的相关成分1092个，其中满足OB≥30%的成分共有578 个，满足DL≥0.18 的成分380 个。根据ADME 参数筛选标准，同时满足OB≥30%与DL≥0.18 的成分共有156 个。

2.2 逍遥丸与高泌乳素血症共同靶点预测 从TCMSP 数据库靶点预测模型配对分析得到逍遥丸的潜在靶点116 个，从GeneCards、OMIM、PharmGKB数据库中得到高泌乳素血症的相关作用靶点198个，将二者进行匹配，得到逍遥丸治疗高泌乳素血症的靶点14 个（见表2）；并通过Cytoscape 软件绘制逍遥丸-靶点-高泌乳素血症交集图（见图1）。图中绿色节点代表疾病靶点，红色节点代表药物靶点。

表2 逍遥丸治疗高泌乳素血症靶点信息

图1 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症交集图

2.3 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症网络构建 根据逍遥丸-靶点-高泌乳素血症交集靶点信息，利用cytoscape3.8.0 软件构建相互作用调控网络模型，见图2。

图2 逍遥丸与高泌乳素血症相互作用调控网络模型

2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析 根据逍遥丸-靶点-高泌乳素血症交集靶点信息，通过STRING数据库得到蛋白-蛋白相互作用网络（见图3）。图3中的每个圆点代表一个蛋白，共有14 个蛋白基因；不同的颜色连线代表不同的定义（黄色-文本挖掘的证据，黑色-共表达的证据，浅蓝-同源性的证据，紫色-共进化的证据，红色-基因融合的证据，绿色-基因连接的证据）。

图3 交集基因的蛋白-蛋白相互作用网络

2.5 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症基因功能（GO）富集分析 对逍遥丸治疗高泌乳素血症的14 个靶点基因通过David 数据库生物分子功能注释系统进行基因功能（GO）的富集分析，包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）3 个分支，根据P＜0.05，筛选得到47 个过程（见图4）。结果表明，逍遥丸治疗高泌乳素血症作用的靶点主要富集在对基因表达的正调控、信号转导、RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、乳腺泡发育、细胞增殖调控、肽基丝氨酸磷酸化的正调控、MAPK 级联的正调控、RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录起始、应对缺氧、雌二醇刺激的细胞反应、对雌激素的反应等31 个生物过程；基底外侧质膜、细胞外间隙、细胞外区域3 个细胞组成；ATP酶结合、类固醇结合、类固醇激素受体活性、酶结合、蛋白结合、乙酰胆碱结合、转录激活因子活性，RNA聚合酶Ⅱ启动的特异性DNA 结合等13 个分子功能。

图4 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症的基因功能（GO）富集分析

3.6 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症通路注释（KEGG）富集分析 对逍遥丸治疗高泌乳素血症的14 个靶点基因应用R×64 4.0.0 软件进行通路注释（KEGG）富集分析，获得与高泌乳素血症相关的通路有6 条（见图5）。由图可知：逍遥丸治疗高泌乳素血症的通路主要富集在EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、癌症中的蛋白多糖、HIF-1 信号通路、雌激素信号途径、乳腺癌、膀胱癌通路。

图5 逍遥丸-靶点-高泌乳素血症通路（KEGG）富集分析

4 讨论

逍遥丸由柴胡、当归、白芍、白术、茯苓、甘草和薄荷组成，其中柴胡为君药，疏肝镇静、开解郁气；当归、白芍为臣药，当归活血补血、调经止痛，白芍柔肝止痛、平抑肝阳、敛阴收汗、养血调经；白术、茯苓、甘草、薄荷共为佐药，白术补脾益胃和中、燥湿利尿消肿，茯苓健脾渗湿止泻、养心宁心安神，甘草益气补脾和胃，薄荷疏散郁遏之气，诸药共奏疏肝理气健脾、益气养血调经之功效[9]。临床上，该方广泛应用于妇女乳腺增生、经前期综合征、月经失调、多囊卵巢综合征、围绝经期综合征以及抑郁症、焦虑症等多种疾病，临床疗效确切。血泌乳素血症在中医中并无特定病名，因其临床症状多表现为闭经、不孕、溢乳、月经不调，故多从月经病和溢乳方面探讨其病因病机，主要责之于肝、脾、肾三脏功能失调，气滞、痰浊、肝火及瘀血为患。本研究初步筛选出逍遥丸中黄芩苷、异鼠李素、豆甾醇、白芍苷、白术内脂、茯苓酸等156个活性成分，最后挖掘出逍遥丸治疗高泌乳素血症的14 个关键靶点，并制作出与之相关联的复杂的网络图，提示中药复方制剂中的有效成分与以作用靶点的存在着密切关系，也反映出中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路的特点，这与中医整体观念与辨证论治思想不谋而合。

从DAVID 和R 软件对14 个靶点富集分析结果可知，逍遥丸主要通过转录调控、细胞增殖调控、MAPK 级联调控、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、癌症中的蛋白多糖、HIF-1 信号通路、雌激素信号途径、乳腺癌等通路来发挥治疗高泌乳素血症的作用。刘琛等[10-11]研究表明，当归芍药散可能作用于多巴胺D2 通过cAMPP-PKA 信号通路发挥治疗高泌乳素血症模型大鼠的作用。张芸娜等[12]研究显示，柴郁寄生汤治疗高泌乳素血症对改善卵巢功能有良好疗效，其作用机制可能是调节卵巢PRL/PRLR-JAK2/STAT5 信号传导通路相关因子的表达，进而改善雌二醇、促卵泡激素等生殖激素水平。陈婧[13]研究显示，加味逍遥散通过拮抗D1 受体，强化D2 受体的激动作用，一方面对下丘脑多巴胺MAPK-P38MAPK 通路产生影响，改变下丘脑多巴胺的功能水平，通过多条级联反应链的参与，降低血清催乳素水平，另一方面D2 受体效应被强化后促进了DA 与之结合，增加催乳素抑制因子（PIF）的分泌而降低PRL 水平；另外，在D1 受体起主要作用时，会产生肾上腺素能副作用，如恶心、呕吐、头晕等，而中药治疗高泌乳素血症的副作用明显低于溴隐亭，可能也与中药对D1 受体的拮抗作用更强有关。以上研究 与本研究结果相一致，而对于还未探究的通路需进一步深入研究。

综上所述，本研究通过采用网络药理学的手段，探讨逍遥丸治疗高泌乳素血症可能的关键基因和作用分子机制，为治疗高泌乳素血症提供新的切入点，为进一步挖掘其潜在的机制提供参考。但由于数据库中纳入的相关信息来源于不同的试验条件，且中药在配伍过程中相互作用可能形成新的成分，故纳入分析的成分并不能反映其实际作用于人体的成分，逍遥丸治疗高泌乳素血症的复杂机制还需进一步验证。