二甲双胍通过激活Nrf2 通路干预PC12 细胞H2O2氧化损伤的机制研究

盛 琦 王国涛 徐道剑

脑缺血是全世界发病率高和死亡率高的中枢神经系统损伤疾病[1]。研究发现，长时间严重缺血会导致神经细胞丢失、认知和运动功能障碍[1]。目前临床采取溶栓法治疗脑缺血，但溶栓后的血液再灌注会进一步通过诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）加重缺血区组织的损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）[2]。因此，使用抗氧化剂或激活抗氧化通路诱导剂是治疗脑缺血/再灌注的有效策略。二甲双胍为双胍类口服降血糖药，临床上用于肥胖的2型糖尿病[3]。相关研究发现，在脑缺血/再灌注模型中，二甲双胍可减少神经损伤，促进神经细胞增殖和分化，减轻脑缺血/再灌注损伤[4]。Zhao 等[5]发现二甲双胍通过激活AMPK 通路保护PC12 细胞和海马神经元免受过氧化氢（H2O2）诱导的氧化损伤，但二甲双胍对氧化应激的潜在保护作用及其机制需要进一步研究阐明。本研究通过建立H2O2诱导PC12 细胞氧化损伤模型探讨二甲双胍抗氧化机制，报道如下。

1 实验材料

1.1 细 胞 大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12 细胞）购于中国科学院上海细胞库。

1.2 药 物 二甲双胍（规格：1g/支，批号N304300，上海阿拉丁试剂有限公司）。

1.3 试 剂 CCK-8 试剂盒（批号C0037）、乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（批号C0016）、Hoechst 33342染色液（批号C1025）和ROS 检测试剂盒（批号S0033S）购自碧云天生物有限公司。qRT-PCR 引物合成和Lipofectamine 2000 由赛默飞购得；核因子E2 相关因子2（Nrf2）（批号12721）、血红素加氧酶-1（HO-1）（批号86806）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，批号5174）购自Cell Signaling 公司；胎牛血清（批号30044333）购自Gibco 公司；H2O2（批号H112517）和多聚甲醛（批号C104188）购自上海阿拉丁有限公司。

2 方 法

2.1 细胞培养 将PC12 细胞培养在含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素的RPMI-1640 培养液中，在5%CO2、37℃的培养箱内培养待使用。

2.2 细胞分组 将PC12 细胞分别设置五组，DMSO组，H2O2组，二甲双胍低（0.5mmol/L）、中（1mmol/L）、高（2mmol/L）剂量组。

2.3 细胞活力检测 取对数生长期的PC12 细胞接种在96 孔板上，并放置过夜。用不同浓度二甲双胍（0.5、1 和2mmol/L）处理24h 后，再用100μmol/L H2O2处理24h。将10μL 的CCK-8 溶液添加到每个孔中，将细胞在培养箱中培养1h，并通过自动酶标仪对450nm 处的吸光度进行定量，最后计算每组细胞活力的相对百分数。

2.4 LDH 测定 取对数生长期的PC12 细胞接种在96 孔板上，并放置过夜。用不同浓度（0.5、1 和2mmol/L）的二甲双胍处理24h 后，再用100μmol/L H2O2处理24h，然后根据说明书的实验步骤确定每组培养基中释放的LDH 的活性。

2.5 Hoechst 33342 染色法检测细胞凋亡 取对数生长期的PC12 细胞接种在6 孔板上，并放置过夜。用不同浓度（0.5、1 和2mmol/L）二甲双胍处理24h后，再用100μmol/L H2O2处理24h。在4℃下用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水固定10min，然后将细胞与Hoechst 33342 染色液孵育20min 以染色细胞核。用PBS 洗涤2 次后，在荧光显微镜下观察凋亡细胞，计算每组凋亡率。

2.6 ROS 水平测定 取对数生长期的PC12 细胞接种在6 孔板上，并放置过夜。用不同浓度（0.5、1 和2mmol/L）二甲双胍处理24h 后，再用100μmol/L H2O2处理3h。室温避光加入DCFH-DA 后孵育30min。细胞消化并用PBS 冲洗，离心，通过流式仪检测ROS 含量，计算每组ROS 的水平。

2.7 Nrf2 和HO-1 mRNA 水平测定 取对数生长期的PC12 细胞接种在6 孔板上，并放置过夜。用不同浓度二甲双胍（0.5、1 和2mmol/L）处理24h 后，收集细胞，用TRIzol 试剂提取总RNA 并检测RNA 的质量和数量。然后，用M-MLV 逆转录酶进行逆转录及进行进一步的PCR 反应，最后计算每组的相对mRNA 含量，GAPDH 被用作内部对照。其中引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2.8 Nrf2 和HO-1 蛋白水平测定 取对数生长期的PC12 细胞接种在6 孔板上，并放置过夜。用不同浓度二甲双胍（0.5、1 和2mmol/L）处理48h 后，裂解蛋白并收集蛋白，变性得到蛋白样品。将等量蛋白质的样品在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后转移至聚偏二氟乙烯膜上，并分别用Nrf2 和HO-1 一抗在4℃孵育过夜。TBST 洗涤膜后，用二抗在室温下孵育1.5h，洗涤后于ECL 孵育显影凝胶成像系统中曝光成像，使用ImageJ 软件对每组条带的强度进行定量分析。

2.9 沉默Nrf2基因测定细胞保护作用 取对数生长期的PC12 细胞接种在6 孔板上，并放置过夜。将稀释的siRNA 和Lipfectamine2000 试剂混合均匀，室温下放置20min，再将混合液加入到6 孔板中；加入不同浓度（0.5、1 和2mmol/L）二甲双胍孵育16h，再加入H2O2损伤24h。用MTT 溶液在37℃处理细胞。甲瓒晶体溶解，并通过自动酶标仪对450nm 处的吸光度进行定量，计算每组细胞活力的相对百分数。siRNA 引物序分别如下：siRNA Nrf2：上游引物5'-GGGUAAGUCGAGAAGUGUUTT-3'，下游引物5'-AACACUUCUCGACUUACCCTT-3'。

2.10 统计学方法 每组实验重复3 次，实验数据用均数±标准差（±s）表示，应用SPSS 25.0 统计软件进行数据整理分析，多组比较采用单因素方差分析，两组比较使用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 二甲双胍对PC12 细胞的损伤作用 与DMSO组比较，随着浓度的递增，二甲双胍对PC12 细胞毒副作用减弱（P＜0.05）。见表2。

表2 二甲双胍对PC12 细胞的损伤作用（%，±s）

表2 二甲双胍对PC12 细胞的损伤作用（%，±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；二甲双胍低剂量组为0.5mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍中剂量组为1mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍高剂量组为2mmol/L 二甲双胍处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05

3.2 二甲双胍对H2O2诱导PC12 细胞损伤的保护作用 与H2O2组比较，随着浓度增加二甲双胍能依赖性提高H2O2诱导PC12 细胞的细胞活力（P＜0.05）。见表3。

表3 二甲双胍对H2O2 诱导PC12 细胞损伤的保护作用（%，±s）

表3 二甲双胍对H2O2 诱导PC12 细胞损伤的保护作用（%，±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍低剂量+H2O2 组为0.5mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；二甲双胍中剂量+H2O2组为1mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；二甲双胍高剂量+H2O2 组为2mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05

3.3 二甲双胍减少H2O2作用下LDH 的释放量 与DMSO 组比较，PC12 细胞经H2O2作用，细胞内的LDH 释放量增加。但当高剂量二甲双胍与H2O2联合作用后，细胞内的LDH 释放量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组PC12 细胞LDH 释放量比较（±s）

表4 各组PC12 细胞LDH 释放量比较（±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍高剂量+H2O2 组为2mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05

3.4 二甲双胍降低H2O2诱导的细胞凋亡 与DMSO 组比较，PC12 细胞经H2O2作用，细胞凋亡率增加。但当二甲双胍与H2O2联合作用后，细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见表5，图1。

图1 二甲双胍降低H2O2 诱导的细胞凋亡（×200）

表5 各组PC12 细胞凋亡率比较（%，±s）

表5 各组PC12 细胞凋亡率比较（%，±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍高剂量+H2O2 组为2mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05

3.5 二甲双胍降低H2O2导致的ROS 水平 与DMSO 组比较，PC12 细胞经H2O2作用，细胞ROS 水平升高（P＜0.05）。但当二甲双胍与H2O2联合作用后，细胞ROS 水平降低（P＜0.05）。见表6。

表6 各组PC12 细胞ROS 含量比较（%，±s）

表6 各组PC12 细胞ROS 含量比较（%，±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍高剂量+H2O2 组为2mmol/L 二甲双胍+H2O2 处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05；与H2O2 组比较，bP＜0.05

3.6 二甲双胍激活Nrf2/HO-1 信号通路 与DMSO组比较，二甲双胍能够浓度依赖性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 水平（P＜0.05）。Western blot 结果显示，二甲双胍能够浓度依赖性地提高Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平（P＜0.05）。见表7-8，图2。

图2 二甲双胍提高Nrf2 和HO-1 蛋白表达

表7 各组Nrf2 和HO-1 mRNA 相对表达量比较（±s）

表7 各组Nrf2 和HO-1 mRNA 相对表达量比较（±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍低剂量组为0.5mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍中剂量组为1mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍高剂量组为2mmol/L 二甲双胍处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05

3.7 二甲双胍通过Nrf2 的激活起到保护作用DMSO 组细胞活力（100.00±0.00）；H2O2组细胞活力（62.33±3.21）；二甲双胍高剂量+H2O2组细胞活力（78.02±7.63）；二甲双胍高剂量+H2O2+siNrf2 组细胞活力（59.77±2.25）。与二甲双胍高剂量+H2O2组比较，沉默Nrf2 后细胞存活率降低（P＜0.05）。

表8 各组Nrf2 和HO-1 蛋白相对表达量比较（±s）

表8 各组Nrf2 和HO-1 蛋白相对表达量比较（±s）

注：DMSO 组为DMSO 处理；H2O2 组为H2O2 处理；二甲双胍低剂量组为0.5mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍中剂量组为1mmol/L 二甲双胍处理；二甲双胍高剂量组为2mmol/L 二甲双胍处理；DMSO 为二甲基亚砜；与DMSO 组比较，aP＜0.05

4 讨论

缺血性脑卒中是因脑动脉血栓梗塞而造成的一种高致死率、高致残率的脑血管疾病，溶栓是缺血性脑卒中的重要治疗手段[1]。然而，溶栓后的CIRI 会加重疾病进展的可能。研究发现，CIRI 的发生涉及多个病理机制，如氧化应激损伤、炎症因子损伤、钙超载等，其中氧化应激是其最为核心的致病机制[6-8]。在CIRI 的病理过程中，氧化应激会产生大量的ROS，破坏细胞的正常功能，降低多种氧化酶的活性，造成脂质、蛋白质和DNA 等的损伤，最终诱导脑细胞凋亡甚至脑组织坏死[8]。因此，使用抗氧化剂清除ROS 是治疗CIRI 的一种重要手段。

研究表明，抗氧化剂能够通过激活抗氧化信号通路，上调抗氧化蛋白表达来清除ROS。其中Nrf2/ARE 是重要的抗氧化信号通路之一，抗氧化剂刺激后，Nrf2 与胞浆蛋白伴侣分子Keap1 解耦联合后进入细胞核，与抗氧化反应元件ARE 结合，启动HO-1等蛋白表达间接清除ROS[9]。本实验结果发现，当不同浓度的二甲双胍（0.5、1 和2mmol/L）作用PC12 细胞后，其对PC12 细胞未表现毒害作用，低中浓度下对PC12 细胞的细胞活力具有轻微的促进作用。因此，本研究选用该三组药物浓度进行后续的研究。研究表明，H2O2通过增加ROS 的产生而诱导氧化应激损伤，因此我们建立H2O2诱导PC12 细胞损伤模型研究二甲双胍的抗氧化作用。我们发现相对于DMSO 组，H2O2处理组的细胞生存率明显降低，当二甲双胍和H2O2共同作用下，细胞生存率呈浓度依赖性提高。研究发现，H2O2能够诱导细胞凋亡，破坏细胞膜结构，导致氧化应激相关酶LDH 释放[10]。本研究结果发现，H2O2处理PC12 细胞后，细胞的凋亡率提高，但二甲双胍处理后能够降低细胞凋亡率。二甲双胍浓度依赖性地降低LDH 的释放，同时，二甲双胍能够降低PC12 细胞内ROS 水平，说明二甲双胍通过降低ROS 水平抑制细胞凋亡和减少LDH 释放起到细胞保护作用。研究结果表明，二甲双胍够浓度依赖性地提高Nrf2 和HO-1 mRNA 和蛋白水平，沉默Nrf2 后，二甲双胍可降低H2O2诱导的细胞损伤，提示二甲双胍可能通过激活Nrf2/HO-1 通路起到细胞保护作用。

综上所述，二甲双胍可能是一个Nrf2 诱导剂，其通过激活Nrf2/HO-1 通路对H2O2诱导的PC12 细胞损伤起到保护作用。