电针水沟穴对脑梗死模型大鼠脑血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表达的影响

李 蕾 张 潋 范立红 周莎白 赵 晶 欧阳侃

脑梗死又称缺血性脑卒中，是临床常见的难治性疾病，改善脑循环是治疗脑梗死的关键环节，调节血管平滑肌收缩是目前研究的热点[1]。脑血管平滑肌钙样蛋白（Calponin）和钙调结合蛋白（Caldesmon）是缺血状态下调节血管平滑肌收缩运动的重要信号通路因子[2]。本研究采用腔内线栓法阻滞大鼠左侧大脑中动脉，制备脑梗死模型，以水沟穴作为醒脑开窍针刺法的主穴，研究电针对脑梗死大鼠脑血管平滑肌Calponin、Caldesmon 表达的影响，探讨电针治疗脑梗死作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康雌性Wistar 大鼠78只，体质量（180±10）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。由浙江中医药大学动物实验中心饲养，采用代谢笼适应性喂养1 周。普通饲料喂养，自由饮水。动物饲养环境设置：室温24℃，湿度45%～75%。实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012，本实验经浙江中医药大学伦理委员会审核通过（批号IACUC-2018121706）。

1.2 主要试剂及仪器 Calponin 抗体（Abcam 公司，美国，批号46794）；Caldesmon 抗体（Abcam 公司，美国，批 号32330）；Goat anti-Rabbit IgG Antibody（biosharp 公司，中国，批号BL003A）；RIPA 裂解液（批号P0013D）、BCA 试剂盒（批号P0011）购自上海碧云天生物技术公司；ECL 发光试剂盒（Merck Millipore 公司，美国，批号1822101）；激光多普勒血流仪（瑞典百灵威中国公司，型号：Periflux System 5000）；康岭电针仪（扬州康岭医用电子仪器有限公司，型号：G91-E）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf AG 公司，型号：5427R）；数码凝胶图像分析处理系统（上海天能科技有限公司，型号：GIS－2008）。

1.3 动物分组及模型建立 78 只大鼠，手术前禁食12h，采用随机数字表法分为空白组6 只，模型组、电针组、假手术组各24 只。造模方法[3]：将大鼠置于仰卧位，腹膜内注射10%水合氯醛（3mL/kg 体质量）。沿颈部正中偏左侧切口，依次分离出左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后在颈总动脉近心端、颈外动脉和颈内动脉分叉处放置动脉夹。在两动脉夹之间用1mL 注射器扎一个小孔，选择直径为0.204mm的尼龙线栓插入小孔，插入后放开颈外动脉和颈内动脉分叉处动脉夹，接着继续插入线栓，总计长度为18～22mm，线栓进入颈内动脉至稍遇阻力即停止进线，结扎线栓。假手术组大鼠除不插入线栓外，其余步骤相同；空白组大鼠除同样抓取固定外，不做任何处理。

1.4 干预方法 电针组大鼠水沟穴定位以实验针灸穴位标准为基础[4]，使用“华佗牌”毫针刺入大鼠鼻中隔2mm，并在该部位下约2mm 处刺入一针作为参考电极，水沟穴接电针仪的正极，参考电极接负极，用15Hz、1mA、连续波电刺激持续20min。模型组、假手术组、空白组大鼠在相应时间段内，同样抓取固定，不进行电针干预。

1.5 标本取材 模型组、电针组和假手术组大鼠分别于造模后0.5、1、3、6h 各处死6 只，空白组大鼠于6h 后处死。分别剥离大鼠大脑，在外科显微镜下分离和剪取梗死侧的大脑动脉。

1.6 免疫印迹法观察大鼠脑血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 表达 用RIPA 裂解液抽提蛋白，采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定后，各样品取20μg，加等量样本处理液后，100℃煮沸5min，Calponin 采 用12% SDS－PAGE 变 性 电 泳，Caldesmon 采用8% SDS－PAGE 变性电泳，经电转移方式转置硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 液封闭2h，而后加入含一抗的封闭液（Calponin抗体稀释度1∶5000；Caldesmon 抗体稀释度1∶6000）4℃恒温室摇床孵育过夜，洗去抗体后加入含二抗的封闭液（比例1∶2000），室温摇床作用1～2h。洗去抗体后按ECL 发光试剂盒说明依次进行化学发光，显影，定影。将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目标带的净光密度值。

1.7 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较行LSD 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脑血管平滑肌Calponin 表达水平比较与假手术组比较，模型组大鼠1、3、6h Calponin 表达下调，差异有统计学意义（P 均＜0.05）；与模型组比较，电针组大鼠3、6h Calponin 表达上调（P 均＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠脑血管平滑肌Calponin 表达水平比较（±s）

表1 各组大鼠脑血管平滑肌Calponin 表达水平比较（±s）

注：电针组给予水沟穴电针干预；模型组插线栓不电针；空白组和假手术组仅抓取固定，不进行电针干预；Calponin 为肌钙样蛋白；“-”为无此项数据；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

2.2 各组大鼠脑血管平滑肌Caldesmonn 表达水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠1、3、6h Caldesmonn 表达下调，差异有统计学意义（P 均＜0.05），与模型组比较，电针组大鼠1、3、6h 表达均上调（P 均＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠脑血管平滑肌Caldesmon 表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠脑血管平滑肌Caldesmon 表达水平比较（±s）

注：电针组给予水沟穴电针干预；模型组插线栓不电针；空白组和假手术组仅抓取固定，不进行电针干预；Caldesmon 为钙调结合蛋白；“-”为无此项数据；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3 讨论

研究表明，缺血性中风患者急性期进行针刺治疗可抑制炎性因子产生，起到保护脑组织、恢复脑细胞神经功能的作用[5-6]。针刺亦可以通过调节脑血管舒缩，达到促进脑循环而治疗脑梗死的效果[7]。

水沟穴是“醒脑开窍”针法的重点穴位，针刺水沟穴可有效治疗中风。研究表明，针刺水沟可以改善脑循环，促进建立侧支循环，并能抑制脑神经细胞的凋亡[8-9]。针刺大脑中动脉闭塞模型（middle cerebral artery occlusion model，MCAO）大鼠水沟穴，可以下调蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）水平和活性，缓解大脑中动脉平滑肌痉挛[10]。不同频率电针刺激水沟穴具有调控大鼠血脑屏障通透性的效应，可抑制大脑皮层毛细血管内皮细胞的表达[11]。本研究结果显示，经水沟穴电针干预，电针组模型大鼠Calponin、Caldesmon 表达均呈上调（P＜0.05）。

PKC-δ 是一种炎症调节因子，它可以调节核转录因子（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）和促炎基因如白细胞介素-1β、白细胞介素-6 表达，激活细胞因子和趋化因子的分泌[12]。Calponin、Caldesmon是存在于脑血管平滑肌中的重要收缩抑制蛋白，脑缺血时PKC 激活，Calponin、Caldesmon 磷酸化，不再抑制三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶活性，促使血管平滑肌持续收缩，进一步导致缺血性脑损害[13-14]。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组Calponin、Caldesmonn 表达下调（P＜0.05），而与模型组相比，电针组Calponin、Caldesmonn 表达上调（P＜0.05），表明经过电针干预后大鼠脑血管平滑肌Calponin 和Caldesmon 蛋白表达下调延缓。

综上所述，电针水沟穴可以抑制脑梗死大鼠脑血管平滑肌收缩关键蛋白Calponin、Caldesmon 下调，推测电针水沟穴通过改善脑梗死模型大鼠脑血管平滑肌收缩，从而达到治疗脑梗死的作用。