加味麻杏石甘汤对放射后肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-6、TLR2、TLR4 表达的影响

陈 珠 钟亚珍 陈 帅 林胜友

放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤放疗后常见的一种并发症，包括早期的急性放射性肺炎和后期的放射性肺纤维化[1]。放射性肺损伤不仅限制肿瘤放疗剂量，也影响后续的治疗和患者的生存质量。本研究采用加味麻杏石甘汤在放射前干预肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ细胞），通过检测各组白细胞介素-6（IL-6）、Toll样受体2（TLR2）、Toll样受体4（TLR4）mRNA 和蛋白的表达以及细胞活力，探讨其干预放射性肺损伤的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞与动物 AT-Ⅱ细胞株，美国ScienCell 公司提供；清洁级SD 大鼠18 只，体质量200～250g，雌雄各半，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016。本实验研究经浙江中医药大学实验动物伦理委员会审核通过，审批号：2016226。动物实验合格证号：SYXK（浙）2013-0184。实验期间，动物自由进食，明暗各12h。

1.2 药物与试剂 中药饮片（炙麻黄、石膏、赤芍、杏仁、桑白皮、金银花、甘草），购自杭州市肿瘤医院，浙江中医药大学药学院负责质控；阿米福汀，购于杭州市肿瘤医院，大连美罗公司，批号53 171201；RMPI-1640 培养基，Hyclone 公司，批号SH30809.01B；胎牛血清，美国Gibco 公司，批号16000-044；Trizol 试剂，美国Invitrogen 公司，批号1596-026；SYBR Green Real-time PCR 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒，美国Thermo 公司，批号分别为#K0223、PICPI23223；逆转录试剂盒，Fermentas 公司，批号#K1622；NC 膜，millipore 公司，批号HATF00010；IL-6、TLR2、TLR4一抗，美国Abcam 公司，批号分别为Ab6672、Ab16894、Ab13556；GAPDH 一抗，CST 公司，批号#5174；羊抗兔HRP 标记二抗、羊抗鼠HRP 标记二抗，碧云天公司，批号分别为A0208、A0216；青链霉素混合液（100X）、胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%），Solarbio 公司，批号分别为P1400-100、T1300-100；CCK-8 试剂，SAB 公司，批号CP002。

1.3 仪 器 ABI-7300型Real-time 检测仪，美国ABI 公司；TG-16M型低温冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；K30型旋涡振荡器，青浦泸西仪器厂；PRO200型电动匀浆机，FLUKO 公司；mini protean 3 cell型电泳仪，美国Bio-Rad 公司；PS-9型电转仪，大连竞迈科技有限公司；HI1210型水浴锅，莱卡公司；Tanon-5200型成像系统，Tanon 公司；BHC-1300IIB2型生物安全柜，苏州金净净化设备公司；Thermo Forma 3111型CO2型恒温培养箱，美国Thermo 公司；XDS-500C型显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；DNM-9602型酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养 AT-Ⅱ细胞放入含10%胎牛血清、1%双抗（青链霉素混合液）的RMPI-1640 培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。显微镜下观察细胞为贴壁细胞。

2.2 含药血清制备 加味麻杏石甘汤由炙麻黄9g，石膏18g，赤芍、杏仁、桑白皮各12g，金银花9g，甘草6g 组成，制成药物浓度为2.44g/mL 水煎剂。将18 只大鼠按随机数字表法分为对照组6 只，模型组12只。模型组按19.5g·kg-1·d-1予加味麻杏石甘汤煎液4mL，对照组予0.9%氯化钠溶液4mL，灌胃给药每天2 次，每次2mL，连续给药3 天。末次给药2h 后，以10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，分别制备血清，灭活、过滤除菌、分管，同组血清混合，分装至1mL 离心管中，-20℃冻存4 周使用，避免反复冻融。

2.3 分组及造模 将AT-Ⅱ细胞分为六组：空白对照组（10%正常大鼠血清）、模型组（10%正常大鼠血清）、含药血清组（含药血清浓度分别为2%、4%、10%）、阿米福汀组（10%正常大鼠血清，按4μg/mL阿米福汀[2]作用于细胞）。每组均设3 个复孔。X 线照射前药物预培养0.5h，然后采用3.64Gray/min，总剂量8Gray 的X 线照射，照射后培养24h。

2.4 CCK-8 法检测细胞增殖活力 将处于对数生长期的AT-Ⅱ细胞，显微镜下计数后制成3×104个/mL的细胞悬液，按3×103个/孔接种到96 孔培养板，37℃培养过夜。根据上述2.3 方法分组和处理，24h后，按1∶10 体积比混合CCK-8 和无血清必需基本培养基，向待测孔中加入含CCK-8 溶液100μL，在37℃、5%CO2培养箱中孵育1h，用酶标仪测定450nm波长处吸光度。

2.5 Real-time PCR 检测IL-6、TLR2、TLR4 mRNA的表达 采用Trizol 法裂解细胞，提取细胞总mRNA后，检测RNA 的浓度和纯度，用逆转录试剂盒合成cDNA，采用25μL 体系进行Real-time PCR 扩增获得基因片段。逆转录反应条件：37℃ 60min，85℃5min。Real-time PCR 反应条件：95℃预变性10min；40 个循环（95℃ 15s，60℃ 45s）。熔解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算结果。引物如下：IL-6：forward 5'-GCACCTCAGATTGTTGTTG-3'，rverse 5'-AGTGTCCTAACGCTCATAC-3'；TLR2：forward 5'-GGTGTCTGGCATGTGCTGTG-3'，rverse 5'-GCTCCTGGACCATAAGGTTCTC-3'；TLR4：forward 5'-CCGCTTTCACTTCCTCTCAC-3'，rverse 5'-CATCCTGGCATCATCCTCAC-3'；GAPDH：forward 5'-AATCCCATCACCATCTTC-3'，rverse 5'-AGGCTGTTGTCATACTTC-3'。上述引物均由基尔顿生物科技（上海）有限公司合成。

2.6 Western blot 检测IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达采用蛋白裂解液提取AT-Ⅱ细胞总蛋白，使用BCA 法蛋白定量，加入适量上样缓冲液，沸水浴10min 变性；SDS-PAGE 凝胶上电泳后，采用半干转法将蛋白电转移至NC 膜；用5%脱脂奶粉室温封闭1h 后，加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜；TBST 洗膜后，加入1:1000 稀释HRP 标记的二抗，室温孵育1h；TBST 洗膜后，加入ECL 发光液，显影、定影，放入成像系统扫描。以GAPDH 作为蛋白内参。

2.7 统计学方法 应用SPSS 25.0 软件对实验数据进行统计分析。计量资料均符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用Turkey 检验（方差齐）。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组AT-Ⅱ细胞活力比较 与空白对照组比较，射线照射后，模型组细胞活力显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，10%含药血清组和阿米福汀组细胞活力显著增加（P＜0.01）。与阿米福汀组比较，10%含药血清组细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组AT-Ⅱ细胞活力比较（%，±s）

表1 各组AT-Ⅱ细胞活力比较（%，±s）

注：空白对照组为10%正常大鼠血清处理细胞；模型组为10%正常大鼠血清处理细胞+X 线照射；2%、4%、10%含药血清组分别为2%、4%、10%大鼠含药血清处理细胞+X 线照射；阿米福汀组为10%正常大鼠血清和阿米福汀（4μg/mL）处理细胞+X 线照射；AT-Ⅱ细胞为肺泡Ⅱ型上皮细胞；与空白对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

3.2 各组AT-Ⅱ细胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达水平比较 与空白对照组比较，射线照射后，模型组IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达均显著升高（P 均＜0.01）。与模型组比较，4%、10%含药血清组和阿米福汀组IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达均显著下降（P均＜0.01）。与阿米福汀组比较，10%含药血清组IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组AT-Ⅱ细胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达水平比较（±s）

表2 各组AT-Ⅱ细胞IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 表达水平比较（±s）

注：空白对照组为10%正常大鼠血清处理细胞；模型组为10%正常大鼠血清处理细胞+X 线照射；2%、4%、10%含药血清组分别为2%、4%、10%大鼠含药血清处理细胞+X 线照射；阿米福汀组为10%正常大鼠血清和阿米福汀（4μg/mL）处理细胞+X 线照射；IL-6 为白细胞介素-6；TLR2 为Toll样受体2；TLR4 为Toll样受体4；与空白对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

3.3 各组AT-Ⅱ细胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达水平比较 与空白对照组比较，射线照射后，模型组IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达均显著升高（P 均＜0.01）。与模型组比较，10%含药血清组和阿米福汀组IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达显著下降（P 均＜0.01）。与阿米福汀组比较，10%含药血清组IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 各组AT-Ⅱ细胞IL-6、TLR2、TLR4 蛋白表达

4 讨论

放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤放疗的主要限制因素，发生率高达20.3%～36.9%[1，3]，降低了疗效和患者的生存质量，严重时可导致死亡。阿米福汀是临床上常用的细胞保护剂，Devine 和Marignol[4]通过Meta分析发现，阿米福汀可以使非小细胞肺癌患者放疗后发生急性肺毒性的风险降低44%。但阿米福汀价格昂贵且副作用较大，难以广泛应用。

Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）是一种重要的模式识别受体，可通过识别配体参与细胞的固有免疫应答和炎症反应[5]。肺泡上皮细胞可表达多种TLRs 参与固有免疫，包括TLR2 和TLR4[6]。研究表明，脂多糖诱导的急性肺损伤通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进炎症介质的释放，如TNF-α、IL-6 等[7]，抑制TLR4/NF-κB 能改善LPS 诱发的急性肺损伤[8-9]。Kong 等[10]研究发现，甘草酸可通过抑制TLR2 减少脂多糖引起的急性肺损伤。李超等[11]研究表明，养阴清热化瘀方可能通过抑制“TLR4/NF-κB”信号通路，发挥放射防护作用。

放射性肺损伤临床表现为发热、咳嗽、气短乏力、咽干口燥等症状，可归属中医“咳嗽”“喘症”“肺痿”等范畴[12]。中医认为，放射线属热毒燥邪，耗气伤津，灼津炼液成痰，并可灼伤肺络，日久损伤人体正气和阴血。加味麻杏石甘汤在炙麻黄、石膏、杏仁、甘草的基础上，加入赤芍、桑白皮、金银花，以加强其清热解毒，宣肺平喘之效。临床经验性用药发现，加味麻杏石甘汤对放射性肺炎急性期的患者具有较好的治疗效果[13]。本课题组前期实验研究表明，麻杏石甘汤可以明显减轻放疗对大鼠模型的炎性损伤[14]，加味麻杏石甘汤对TGF-β1/Smad 信号转导通路相关因子有多靶点的调控作用[15-16]。本研究结果显示，10%含药血清组细胞活力明显高于模型组（P＜0.01），10%含药血清组细胞中IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表达明显低于模型组（P＜0.01）。提示加味麻杏石甘汤可改善辐射对AT-Ⅱ细胞增殖的抑制作用，并下调IL-6、TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白的表达。

综上所述，加味麻杏石甘汤可能通过抑制TLR2、TLR4 表达，从而抑制TLR 信号通路的传导及其下游炎症因子IL-6 的释放，减轻放射性肺损伤。此外，放射性肺损伤发病机制复杂，对加味麻杏石甘汤放射防护的详细机制还有待进一步研究和探讨。