荧光快速现场评价在恶性胸膜疾病诊断中的应用

王 剑 宋 嘉 陈清勇

随着气管镜介入技术的发展，如何取得足量阳性标本、指导精准治疗是临床医生面临的问题。因此，快速现场评价（ROSE）在国内已越来越受重视。研究表明，ROSE 结合气管镜介入技术，可有效减少操作时间和活检次数，提高诊断阳性率，减少并发症[1-2]。目前国内的ROSE 技术主要是迪夫快速染色法，该法存在一些缺陷，例如对细胞学专业水平要求高、染色过程复杂、试剂有毒易挥发等[3]。本研究对现有的吖啶橙染色法进行改进，首次将荧光染色法引入ROSE，为临床工作者提供新的方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2017 年6 月—2020 年3 月中国人民解放军第903 医院收治的32 例不明原因胸腔积液患者，其中男23 例，女9 例，年龄36～73（59.3±9.4）岁，肺腺癌伴胸膜转移31 例，肺鳞癌伴胸膜转移1 例。所有患者均行内科胸腔镜检查，并行ROSE 评估。本研究经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）年龄18～75岁；（2）胸部CT 或胸片提示胸腔积液，性质不明者；（3）签署检查知情同意书。排除标准：（1）合并严重凝血功能障碍、出血倾向或严重脏器功能不全；（2）不同意接受内科胸腔镜检查者；（3）存在内科胸腔镜检查禁忌。

1.3 检查方法 术前行血常规、凝血功能、乙肝三系、输血三项、心电图、肺功能等常规检查。患者取健侧卧位，超声检查观察胸腔积液及胸膜粘连情况，以确定最佳穿刺点，建立静脉通道，术前0.5h 可肌注地西泮5mg、吗啡5mg 镇静镇痛，同时予心电监护监测生命体征。根据术前定位点，常规消毒铺巾，2%利多卡因逐层局部注射至胸膜，作皮肤切口（1.0～1.5cm），用止血钳逐层钝性分离胸膜壁层，直至穿透壁层胸膜，插入套管针（Trocar）并固定，拔出套管针芯，立即插入胸腔镜，抽出胸水后旋转胸腔镜，按内、前、上、后、下顺序观察脏层、壁层、膈胸膜及肋膈窦，观察组织色泽、弹性、活动度，同时注意术中患者生命体征变化；直视下选择病变部位避开大血管，多处活检（5～15 块），留取胸水标本；术毕，退出胸腔镜及套管，在切口处放置多侧孔20F 引流管接水封瓶行闭式引流，缝合固定引流管。

1.4 标本处理 将适量吖啶橙粉末与95%乙醇混合，配置成0.05%浓度的吖啶橙染色液。（1）将10mL胸水放置于离心管内，离心速度1500r/min，离心5min，弃上清液，用移液枪将细胞沉淀与剩余上清吹打混匀后，吸取适量滴在载玻片上，进行细胞涂片自内向外涂抹出直径约1cm 的圆形，厚薄适度。活检胸膜组织用注射器针头挑起，在载玻片上涂抹直径约1cm 圆形，厚薄适中。上述所有标本一式两份。（2）将所制的玻片分别置于吖啶橙染色液或迪夫染色液中。其中，玻片在吖啶橙染色液中浸泡约30s，再于磷酸盐缓冲液中轻轻洗涤5s 后，擦干玻片底部，加载玻片荧光显微镜下观察。迪夫快速染色法[3-4]：先于迪夫A 液（Diff-quik A）中浸泡约20s；再于磷酸盐缓冲液中轻轻洗涤5s，甩干缓冲液；再把玻片完全浸于迪夫B 液（Diff-quik B）15s；最后清水染缸中水洗5s，擦干玻片底部后于普通显微镜下观察。

1.5 评价标准 由2 名经验丰富的细胞学医师观察细胞成分及形态，进行综合分析，并记录判读结果。迪夫快速染色后发现肿瘤细胞认定为阳性，只见淋巴细胞、间皮细胞、红细胞而无肿瘤细胞，则认定为阴性。吖啶橙染色后凡细胞核呈黄色或绿色，胞质呈火焰样橘红色的荧光，又具备恶性细胞的形态特征者为阳性。细胞核呈亮绿色，胞质呈灰绿色者为阴性。最终诊断由病理科医师依据细胞学、组织病理形态学及免疫组化结果确定。

1.6 观察指标 比较两种染色方法在操作时间、判读所需时间、诊断的敏感度和特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断符合率。其中灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%，阳性预测值=真阳性例数/（真阳性例数+假阳性例数）×100%，阴性预测值=真阴性例数/（真阴性例数+假阴性例数）×100%。总结归纳荧光染色后的细胞学特征。

1.7 统计学方法 应用SPSS 19.0 统计软件。计量）表示，符合正态分布者采用参数检验，不符合正态分布者采用非参数检验；计数资料以例（%）表示，采用χ2检验，诊断符合率采用Kappa 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞经不同染色后细胞学特征 胸膜组织和细胞沉淀涂片经迪夫快速染色后表现为细胞核大，深染，细胞核异型明显，细胞胞浆丰富，背景可见红细胞、淋巴细胞及白细胞（见图1A、C）；胸膜组织和细胞沉淀涂片经吖啶橙染色后表现为肿瘤细胞整体较大，细胞核大、异型明显，呈现强烈的黄色荧光，部分细胞核内可见核仁，胞浆呈现鲜亮的橘红色，个别病例的腺癌细胞可见丰富胞浆，分泌的黏液表现为透明，将细胞核挤至一边。正常细胞如白细胞、淋巴细胞均表现为细胞核小，或有分叶，呈绿色荧光，包浆少，无橘红色荧光（见图1B、D）。

图1 不同染色后的肿瘤细胞学表现

2.2 两种染色方法操作时间、判读简易程度比较结果显示，胸膜组织涂片后经荧光染色，总体耗时（44.69±2.60）s，迪夫染色耗时（54.44±2.80）s，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；胸水沉淀涂片后经荧光染色，总体耗时（44.88±2.22）s，迪夫染色耗时（53.94±4.05）s，两组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。胸膜组织经荧光染色后，判读需（6.53±1.57）s，迪夫染色判读需（6.13±1.31）s，两组比较，差异无统计学意义（P=0.117）；胸水沉淀涂片后经荧光染色，判读需（10.13±2.63）s，迪夫染色判读需（14.31±2.98）s，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 两种染色方法诊断结果比较 32 例病例经常规组织病理学和免疫组化检查，最终均诊断为肺癌伴胸膜转移，液基细胞学检查找到癌性细胞24 例，8例未找到癌性细胞。吖啶橙染色法诊断癌性胸水24例，8 例未找到癌性细胞，对胸水性质鉴别诊断的敏感度为88.0%，特异度为71.4%，阳性预测值为91.7%，阴性预测值为62.5%，与液基结果符合率为84.3%；迪夫快速染色法诊断癌性胸水26 例，6 例未资料以均数±标准差（±s找到癌性细胞，对胸水性质诊断的敏感度为87.5%，特异度为37.5%，阳性预测值为80.8%，阴性预测值为50.0%，与液基结果符合率为80.0%。两种方法比较对胸水最终诊断结果差异无统计学意义（P=0.24）。两种方法均在胸膜组织涂片中找到癌细胞，对胸膜组织诊断的特异度为100%，阳性预测值为100%，与组织病理学诊断结果符合率为100%，两种方法对胸膜活检组织最终诊断结果差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1-2。

表1 吖啶橙染色对胸水沉淀判读结果

表2 迪夫快速染色对胸水沉淀判读结果

3 讨论

目前，国内ROSE 技术主要采用迪夫快速染色，但存在几个问题：（1）操作需四步，耗时时间1～2min，加之涂片、镜下观察、判读，总体耗时需2～4min；（2）迪夫染色剂的A 液为甲醇配置，甲醇具有挥发性及毒性；（3）国内的ROSE 技术主要由肺科医师操作，缺乏细胞病理学知识，并且每个从事ROSE 工作的肺科医师细胞学水平不一，对大部分肺科医生而言判读仍有一定的难度。尽管有研究表明肺科医师经过3 个月的细胞病理学知识培训后，ROSE 判读的准确率可达80%，与病理学家相比（准确率92%）无统计学差异[5-6]，但是临床工作中12%的差距仍可能给临床诊治带来较大困难。因此，寻找一种既能够降低判读难度，又能保证染色效果、缩短操作时间的染色方法对肺科医生而言具有重要意义。

吖啶橙是一种特异性荧光染料，当与细胞内的DNA 结合时发出黄色或黄绿荧光，与RNA 结合时发出橘黄色或橘红色荧光，荧光强度与核酸丰度呈正比[7-8]。肿瘤细胞的DNA、RNA 较正常细胞多，因此荧光更强，色泽更鲜艳，红细胞因无DNA 和RNA，不能发出荧光，因此在细胞背景中被过滤。余泉峰等[9]利用吖啶橙染色寻找尿液中脱落细胞诊断膀胱移行细胞癌400 例，总阳性率可达77%，而HE 染色、巴氏染色法等，阳性率仅40%～60%。马富玲等[10]将前列腺癌细胞系或肾癌细胞系与正常血清混合来模拟循环肿瘤细胞，再用吖啶橙染色后观察，发现肿瘤细胞具有独特的色彩及形态学特征，能够较为容易的和正常细胞区别。

受上述研究启发，我们尝试将这一染色方法引入ROSE，并对恶性胸膜疾病进行初步诊断。传统的吖啶橙染色需经乙醇固定、吖啶橙染色、漂洗等步骤[11]，耗时约15min，不能满足ROSE 的“快速”要求，我们对此进行改进，将吖啶橙直接加入95%乙醇中，实现固定和染色同步，将染色时间缩短为30s。结果显示，两种方法对胸膜活检组织、胸水脱落细胞判读均具有较好的灵敏度、特异度以及阳性预测值，最终病理结果符合率均较高。但吖啶橙染色在判读简易程度、操作时间方面，明显优于迪夫快速染色。我们认为胸水中肿瘤细胞数量不多，迪夫染色后寻找肿瘤细胞较为困难，吖啶橙染色后肿瘤细胞可在荧光下激发出特异性色彩，较为容易找到，因此判读优势明显；胸膜组织活检是针对病变部位直接活检，本身标本阳性率高，组织涂片后肿瘤细胞数量都较大，判读难度不高，因此吖啶橙染色判读无优势。此外乙醇作为溶剂是相对无毒的，避免了甲醇作为溶剂挥发吸入人体后带来的危害。但本研究也存在一些缺陷，如研究的样本量少、荧光显微镜成本高、荧光易淬灭故标本不易长久保存等，需进一步深入研究和改进。

综上所述，吖啶橙染色可作为一种新型的ROSE 手段联合胸腔镜检查用于恶性胸膜疾病的初步诊断，具有简易、快速、准确等优点，值得临床推广应用。