益心泰对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响

孙 涛， 郭志华， 李 雅， 龙 云， 曾 英， 王 月

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

心力衰竭(heart failure，HF)是一类以体循环灌注不足、肺循环瘀血为主要表现的临床综合征，根据心脏彩超结果，临床上分为射血分数保留的心力衰竭和射血分数减低的心力衰竭[1]，但无论是哪一种都会引起心输出量下降，当心率相当时，即表现为每搏量下降。细胞水平研究显示，心力衰竭发生发展的每个阶段中，都与心肌细胞凋亡有着明确相关性[2]。现阶段已证实β-抑制蛋白(β-arrestin)介导的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信号通路的激活可以抑制心肌细胞凋亡[3]，B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)及其相关蛋白(Bcl-2-associated-X-protein，Bax)的蛋白表达是细胞凋亡中至关重要的一环[4]，报道指出Bcl-2/Bax可以被磷酸化的Akt激活表达[5]。基于以上研究，本课题组提出合理假设，β-arrestin通过募集激活Akt进而调控下游Bcl-2/Bax蛋白表达，最终激活心肌保护机制，从而抑制心肌细胞凋亡。中药复方益心泰在临床治疗心力衰已有20年之久，安全性良好，而且疗效已得到充分肯定[6-9]，课题组前期证明，该方能通过抑制G蛋白偶联受体，延缓心力衰竭[10]，但是否能调控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信号通路尚不清楚。本研究拟通过观察益心泰对心衰大鼠心肌细胞凋亡情况及β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信号通路相关蛋白表达的影响，揭示与阐释益心泰治疗心力衰竭的多维作用机制，为今后研究提供充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠60只，雄性，体质量200～230 g，由湖南省人民医院动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2016-0002，动物饲养及实验方案遵循国家《实验动物管理条例》和湖南中医药大学第一附属医院实验动物福利与伦理委员会规范。

1.2 药物、试剂与仪器 益心泰由湖南中医药大学第一附属医院中成药制剂中心提供(批号20180727)，组方药材黄芪15 g、丹参15 g、红花10 g、猪苓10 g、泽泻10 g、葶苈子6 g，每1 g成药含生药3.3 g。卡维地洛(金络)10 mg/片(山东齐鲁制药有限公司，国药准字H20000100)。TUNEL检测试剂(上海罗氏制药有限公司，批号11684817910)；β-arrestin(批号K001487M)、p-Akt(货号4060P)、β-actin(货号3869)、Bcl-2(货号3869)和、Bax(货号14796)均购自湖南秉玉堂生物科技有限公司。Vivid 7.0 彩色超声仪(美国GE公司)；电子显微镜(日本Olympus公司)；UV-365型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

1.3 造模与分组 将60只大鼠随机分为正常对照组10只、造模组50只，参照文献[11]报道采用腹腔注射盐酸阿霉素法造模，第1、3、9、11天剂量为1.0 mg/kg，第5、7、13、15天剂量为2.0 mg/kg，累积12 mg/kg，观察大鼠表征及行为学改变，第16天清晨进行心脏超声检测，指标包括左室射血分数(LVEF)，以指标低于标准值40%为心力衰竭模型成功。称定大鼠体质量，对大鼠一般状态进行监测和评估，若出现体质量减轻、活动量减少、精神不振、毛色黯淡无光，则将其入选为观察对象，从中随机选取30只，再随机分为益心泰组(4.2 g/kg)、卡维地洛组(10 mg/kg)、模型组(等量生理盐水)，每组按照1次/d的频率给药，8周后观察一般情况，对其心脏功能指标、心肌细胞凋亡情况、β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax通路蛋白表达进行检测。

1.4 指标检测

1.4.1 心脏功能指标 取大鼠胸骨旁左室长轴切面，Vivid 7.0 彩色超声仪检测左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)。分别取心尖两腔心切面和心尖五腔心切面，M超检测每搏量(stroke volume，SV)，连续3个心动周期数值，再取各组平均值。

1.4.2 心肌细胞染色、凋亡情况 从福尔马林固定液中取出大鼠心脏，冲洗干净后取部分心肌组织，经脱水、包埋、切片(厚度4 μm)、脱蜡后0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)冲洗2次，在37 ℃下20 μg/mL蛋白酶K消化20 min，0.1 mol/L PBS冲洗2次，在4 ℃下孵育4 min，3%H2O2孵育10 min，0.1 mol/L PBS冲洗2次，新鲜配制TUNEL反应液37 ℃下孵育70 min，0.1 mol/L PBS冲洗2次，每次5 min，自来水冲洗5 min，苏木素复染3 min，乙醇浸泡1～2 s，自来水冲洗5 min，晾干后中性树脂封片，显色结果发现凋亡心肌细胞呈现深棕黄色。心肌细胞凋亡指数(AI)检测方法为在光镜(×400)下计算细胞凋亡指数，公式为细胞凋亡指数=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%，每组大鼠5张片，每张片均取5个高倍视野计数凋亡细胞数，计算平均值。

1.4.3 相关蛋白表达 取米粒大小的大鼠心室组织，经研磨、裂解、浓度检测后SDS-PAGE分离，再采用电移法将蛋白质转至PVDF膜，丽春红S染色，含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，加入p-Akt、Bax、Bcl-2、β-arrestin、β-actin抗体，在4 ℃下孵育过夜，室温下TBST洗膜后加入二抗孵育2 h，TBST洗膜后与ECL试剂反应，胶片曝光、扫描，并用Gel-Pro Analyzer 4.0软件对结果进行分析。

2 结果

2.1 心脏功能指标变化情况 如表1所示，与正常对照组比较，模型组大鼠左心室舒张末期内径增加(P<0.01)，左室射血分数、左室短轴缩短率降低(P<0.01)，每搏量下降(P<0.01)，提示心力衰竭发生时心脏功能受损严重；与模型组比较，益心泰组、卡维地洛组大鼠左室舒张末期内径减小(P<0.05)，左室射血分数、左室短轴缩短率升高(P<0.05)，每搏量增加(P<0.05)；与卡维地洛组比较，益心泰组大鼠各指标无明显变化(P>0.05)。

表1 各组大鼠心脏功能指标

2.2 心肌细胞凋亡染色情况及凋亡指数变化情况 如表2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡指数增加(P<0.01)，提示存在心肌细胞凋亡；与模型组比较，益心泰组、卡维地洛组大鼠心肌细胞凋亡指数降低(P<0.05)；与卡维地洛组比较，益心泰组大鼠凋亡指数无明显变化(P>0.05)。心肌细胞凋亡染色见图1。

表2 各组大鼠心肌细胞凋亡指数

注：1为正常对照组，2为模型组，3为益心泰组，4为卡维地洛组。

2.3 β-arrestin、p-Akt、Bax、Bcl-2蛋白表达 如图2所示，与正常对照组比较，模型组大鼠β-arrestin、p-Akt、Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01)，Bax蛋白表达增加(P<0.01)；与模型组比较，益心泰组、卡维地洛组大鼠β-arrestin、p-Akt、Bcl-2蛋白表达增加(P<0.05)，Bax蛋白表达减少(P<0.05)；与卡维地洛组比较，益心泰组大鼠各指标无明显变化(P>0.05)。

注：1为模型组，2为正常对照组，3为益心泰组，4为卡维地洛组。与正常对照组比较，▲P<0.01；与模型组比较，△P<0.05； 与卡维地洛组比较，◆P<0.05。

3 讨论

益心泰是湖南中医药大学郭志华教授多年临床经验总结而成的中药复方，由黄芪、红花、猪苓、泽泻、葶苈子等药物组成，该复方主要针对的病机是气虚血瘀水停。方中黄芪用量最重，为君药，是补虚之品，常用于体衰日久、言语低弱、脉细无力者；红花为臣药，活血通经、祛瘀止痛，入心经，《金匮要略》中记载，红蓝花酒方具活血行瘀，利气止痛之功，可见红花为活血之要药；猪苓味甘、淡、平，归心、脾、胃、肺、肾经，为佐药，有利水渗湿消肿之效。配合诸药，共奏益气活血利水之效。

本研究采用盐酸阿霉素腹腔注射制备心力衰竭大鼠模型，这更接近于一种扩张型心肌病模型[12]，其主要表现为心室容量型扩张和收缩功能下降。扩张型心肌病发病率高，2002年抽样调查显示其发病率为19/10万人，且呈逐年上升趋势。扩张型心肌病是诱发心力衰竭的主要原发疾病，但因其病因尚未明确，暂时没有特效药物，致使扩张性心肌病的死亡率居高不下，成为威胁生命健康的大敌[13]。寻找临床疗效确切，作用机制明确的新药迫在眉睫。本研究结果已经证明益心泰对心力衰竭大鼠心脏功能有明确改善作用，不仅使左心室舒张末期内径减小，同时还提高了射血分数和每搏量。

心肌细胞凋亡是心力衰竭的重要病理基础及发病机制之一，这已经成为现阶段的共识。细胞凋亡在机体内无时无刻不在进行，它是一系列极其复杂变化的集合，为维持内环境的稳定，在相关基因的调控作用下，部分细胞发生皱缩，染色质开始聚集，直至细胞分解、吞噬，且此过程具有主动性[14-15]。心肌细胞凋亡现象存在于大多数心血管疾病中，在疾病进展的各个环节中都扮演者极其重要的角色。与大多数组织细胞不同，心肌细胞是不具有再生能力的终末分化细胞，随着心肌细胞凋亡的发生，存活的心肌细胞的数量也不断减少，这个过程中，心力衰竭其实已经在发展之中，虽然大部分患者在此时没有症状，而当由代偿期进入失代偿期时，我们所熟知的终末期心脏疾病——心力衰竭就进入了临床症状期。本研究表明模型组大鼠凋亡细胞占总心肌细胞比例高于正常对照组，而益心泰干预后，凋亡细胞比例降低，证明益心泰改善心脏功能与其有效抑制细胞凋亡有关。

细胞凋亡过程有诸多凋亡激活、抑制因子参与其中，Bcl-2蛋白家族中就有许多这类功能的蛋白成员，如Bcl-2 抗凋亡因子和Bax促凋亡因子[16]。研究报道，p-Akt为Bcl-2/Bax蛋白的上游调控因子，Bcl-2/Bax可以被磷酸化的Akt调控表达[5]。亦有研究证明β-arrestin介导的Akt信号通路的激活可以抑制心肌细胞凋亡[3]。在此基础上，本课题组提出合理假设，β-arrestin通过募集激活Akt进而调控下游Bcl-2/Bax蛋白表达，从而抑制心肌细胞凋亡，保护心脏。本研究表明模型组大鼠心肌组织中β-arrestin、p-Akt及Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加，益心泰干预后，β-arrestin、p-Akt及Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达下降，证实益心泰对β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信号通路可能存在整体调控作用，进一步证实了益心泰对心肌细胞凋亡的抑制作用。

综上所述，本研究已证明益心泰能有效改善心脏功能，在一定程度上抑制心肌细胞凋亡，其机制可能是通过调控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信号通路而实现的，但益心泰的抗心肌细胞凋亡作用是否仅通过调控β-arrestin-Akt-Bcl-2/Bax信号通路实现，仍不十分清楚。后续课题组将采用基因敲除方法，并结合细胞实验进一步验证益心泰抑制心肌细胞凋亡的机制。