鼻敏通窍方对变应性鼻炎模型小鼠IgE和EOS的影响

丁元元， 赵 霞*， 邢琼琼， 董盈妹， 纪建建， 梁众擎

[1.南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029；2.南京中医药大学中医儿科研究所，江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室，江苏 南京 210023]

儿童变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)属中医“鼻鼽”范畴，是一种以突然鼻痒、打喷嚏、流涕和鼻塞为主要临床表现的过敏性疾病，其对小儿生活质量、成长健康及心理状态的负面影响持久而深远[1]。儿童过敏性疾病的负担已成为医疗保健系统面临的主要挑战之一[2]。近年变应性鼻炎日趋成为儿童主要的呼吸道慢性疾病[3]，由于儿童自身的特性，变应性鼻炎的鼻塞症状难以持久改善，对患儿的成长及颌面部发育会产生终身影响[4]，现西药治疗变应性鼻炎以类固醇制剂、抗组胺类药物和白三烯抑制剂为主，有作用靶点单一、疗效短暂、副作用较多缺陷。中国的儿科人群中使用中药的比例很高[5]，大量的临床研究已经证明中医药治疗变应性鼻炎安全有效[6]，中医药对症治疗独具优势。鼻敏通窍方在临床应用多年，其疗效稳定、持久，尤可长效改善鼻塞症状，临床疗效显著。本实验通过建立变应性鼻炎动物模型，从免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)和嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)的角度，初步探讨鼻敏通窍方治疗小儿变应性鼻炎的作用机理。

1 材料

1.1 动物 BALB/c小鼠50只，体质量18～22 g，雌性，SPF级，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证号SCXK(苏)2017-0001。

1.2 药物 鼻敏通窍方，由苍耳子6 g、辛夷6 g(包煎)、川芎6 g、白芷10 g、防风6 g、白芍10 g、乌梅10 g、生石膏15 g组成，由北京同仁堂有限公司南京店提供，经南京中医药大学中药鉴定教研室刘圣金副教授鉴定为正品，药材依次加8、6倍量水浸泡1 h后煮沸2次，每次约30 min，过滤后并浓缩滤液至2 g/mL，装于无菌瓶中，置于4 ℃冰箱中冷藏备用。孟鲁司特钠颗粒，购自杭州默沙东制药有限公司，批号J20140167，蒸馏水溶解，现配现用。

1.3 仪器 ELX800酶标仪，购自美国BioTek公司；电子分析天平(CPA2250)，购自德国Sartorius公司；-80 ℃超低温冰箱，购自美国Thermo公司；移液器，购自德国Eppendorf公司；恒温振荡仪(THZ-C)，购自太仓市强乐实验设备有限公司；高速冷冻离心机，购自德国Eppendorf公司；Accuri C6 Plus流式细胞计数仪，购自美国BD公司。

1.4 试剂 氢氧化铝凝胶，购自西安赫特科技有限公司；卵清蛋白(OVA grade V)，购自美国Sigma公司；小鼠外周血淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，批号LTS1092-200；流式荧光表面抗体CD11C-FITC、Siglec-F-APC(鼠抗)，购自美国eBioscience公司；磷酸盐缓冲溶液(PBS)，购自上海源培生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 50只小鼠适应性饲养3 d后，随机分为空白组(8只)、模型组(8只)、孟鲁司特钠组(8只)、鼻敏通窍方低剂量组(8只)、鼻敏通窍方中剂量组(9只)，鼻敏通窍方高剂量组(9只)，参考文献[7]报道建立小鼠变应性鼻炎模型。除空白组外，各组小鼠在第0、7、14天腹腔注射0.2 mL致敏液(含OVA 40 μg、氢氧化铝凝胶1.5 mg，溶于生理盐水中)，第21天双侧滴鼻OVA溶液(含200 μg OVA)40 μL/只，连续7 d，正常组小鼠以同体积0.9%氯化钠溶液代替。每次滴鼻激发5 h后，空白组，模型组，鼻敏通窍方高、中、低剂量组(2、1.5、1 g/mL)，孟鲁司特钠组(1.35 mg/kg)小鼠每天灌胃给药1次，共7 d。

2.2 样品制备 小鼠末次灌胃给药、禁食不禁水24 h后，摘除眼球取血，3 000 r/min离心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱中，外周血加入小鼠淋巴细胞分离液，梯度离心法分离收集PBMC。脱颈椎处死小鼠，取鼻黏膜组织，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，病理切片进行HE染色。

2.3 指标检测 ELISA法检测小鼠血清中IgE水平，相关试剂盒由杭州联科生物技术股份有限公司提供，操作严格按要求进行。分离出的PBMC用PBS缓冲液洗涤，离心，重悬，加入流式荧光抗体Siglec-F-APC，CD11c-FITC标记，筛网过滤后5 min内上机检测，分析EOS比例。

3 结果

3.1 行为学评分 在小鼠末次鼻腔激发致敏后立即观察30 min，记录喷嚏、流涕、抓鼻情况，叠加量化计分法计分，总分超过5分表示造模成功，评分标准[8]见表1，结果见图1。由此可知，模型组小鼠症状行为学评分高于空白组(P<0.05)，孟鲁司特钠组、鼻敏通窍方组小鼠症状行为学评分低于模型组(P<0.05)。

表1 行为学评分标准

3.2 小鼠鼻黏膜病理学变化

3.2.1 鼻黏膜组织病理学评分 由病理读片工作人员随机观察各组4个高倍视野下EOS、肥大细胞等炎性细胞、纤毛、杯状细胞情况，以及黏膜下层腺体肥大、增生程度及黏膜上皮完整性，并进行分级评分，评定标准见表2，结果见图2。由此可知，模型组显示病理评分高于空白组(P<0.05)，孟鲁司特钠组、鼻敏通窍方中剂量组小鼠病理评分低于模型组(P<0.05)。

注：与空白组比较， #P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

表2 鼻黏膜组织病理学评分标准

3.2.2 鼻黏膜组织HE染色及EOS计数 与空白组比较，模型组小鼠鼻黏膜纤毛柱状上皮细胞排列紊乱，缺乏完整性，纤毛大量脱落，固有层腺体增生明显，并伴有大量炎性细胞的渗出；与模型组比较，鼻敏通窍方组小鼠纤毛柱状上皮细胞排列整齐，偶有脱落，有少量炎性渗出，而孟鲁司特钠组小鼠可见上皮细胞脱落，腺体增生，有少量炎性渗出，见图3A。随机选取3个不同视野(HE，×400)观察，发现模型组EOS计数高于空白组(P<0.05)；孟鲁司特钠组、鼻敏通窍方组EOS计数低于模型组(P<0.05)，见图3B。

注：黄色箭头处为大量性细胞浸润，红色箭头处为固有层腺体增生，黑色箭头处为上皮细胞脱落。与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.3 小鼠外周血IgE表达 模型组小鼠IgE表达高于空白组(P<0.05)，孟鲁司特钠组、鼻敏通窍方组小鼠IgE表达低于模型组(P<0.05)，见图4。

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

3.4 小鼠PBMC中EOS比例 模型组小鼠EOS比例高于空白组(P<0.05)，鼻敏通窍方组小鼠EOS比例低于模型组(P<0.05)，见图5。

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05。

4 讨论

变应性鼻炎是儿童最常见的过敏性疾病之一。主要由IgE介导，即特应性个体吸入过敏原后，过激产生IgE抗体，与各类免疫细胞如EOS、肥大细胞等表面抗体结合，使免疫细胞过度活化，致机体处于致敏状态，释放多种炎性介质，而导致鼻黏膜非感染性慢性炎性浸润[6]。多年相关研究证实IgE是过敏反应的核心介导，总IgE增加已经成为AR主要的诊断标准和治疗靶标[9]。

AR是一种以Th2过度分化为主的鼻黏膜免疫疾病，Th2细胞因子的过量产生和鼻黏膜组织中与过敏相关促炎细胞的大量浸润，导致机体免疫调节功能异常[10]。AR存在速发相和迟发相反应，鼻塞在两者中都是显著的症状[11]。鼻腔黏膜在过敏原反复刺激下，肥大细胞和EOS等炎性细胞聚集鼻腔，导致黏膜肿胀[12]。EOS在变应性鼻炎的生理病理中起着重要的作用[13]，是人类过敏性疾病中重要的效应细胞，可释放促炎介质，在过敏性鼻炎患者的血常规中，EOS数量升高[14]。鼻黏膜EOS积累是导致鼻腔黏膜慢性持续炎症的重要因素。近年研究发现，EOS是一种多功能的白细胞，它参与维持组织的动态平衡、调节针对特定微生物的适应性和固有免疫应答[15]。变应性疾病的抗原呈递细胞不仅激活Th2细胞，也分泌促炎症反应介质，这些因子可诱发上皮细胞产生趋化因子吸引EOS[16]。

祖国医学很早就已经认识到AR的发病与自然环境、气候、人体存在密切的关系，中医认为小儿鼻鼽的发病，除冒受外风、异气，伏风内潜之外，还与患儿肺、脾、肾三脏功能失调密切相关[17]。其病理因素主要为风和痰。小儿肺常不足，气候交替，环境改变之时，异禀质小儿因风邪侵袭而肺失宣降，津液失布；小儿脾常不足，易聚湿为痰；小儿肾常不足，痰根难祛，而致风痰博结，阻碍津液正常运化，使其发生代谢异常，因此出现鼻痒，喷嚏，流涕，鼻塞反复发作无常。鼻敏通窍方主要由苍耳子、辛夷、川芎、白芷、防风、白芍、乌梅、生石膏组成。方中苍耳子、辛夷、白芷有辛阳发散、宣风通窍之功；川芎辛温香窜，活血行气，祛风止痛，可除久病留瘀，祛风同时配伍活血之药，取“治风先治血，血行风自灭”之意，以利风邪消散；白芍、乌梅能滋阴和营，敛津涩涕，又防辛温之药发散太过而耗伤小儿气津；防风为风中润剂，性甘润，既能祛风发表止痒，宣肺气，又有升阳运脾化痰之功，与乌梅组成药对，祛风抗过敏[18]，甘酸敛肺生津，可顺接脏腑阴阳之气；生石膏清肺之郁热。全方祛风行气化痰，驱邪不伤津，敛液不留邪，平衡小儿阴阳。全方配伍根据小儿用药特点，遵从中医整体观念和辨证施治原则，谨守病机，标本兼顾，共奏祛风化痰通窍之效，在临床上获得了持久而显著的疗效。

本实验研究发现，变应性鼻炎小鼠模型体内IgE维持高水平状态，而循环EOS也呈现高表达；变应性鼻炎模型组小鼠鼻黏膜纤毛柱状上皮细胞结构破坏严重，而鼻敏通窍方组小鼠鼻黏膜上皮细胞结构的破坏有所改善。这些结果表明，小儿变应性鼻炎慢性炎症持续存在，鼻敏通窍方能够下调IgE的合成，减少EOS的浸润，维护鼻黏膜纤毛柱状上皮细胞的完整性，而发挥免疫调节效应，改善鼻部慢性炎症，减轻变应性鼻炎的发作。基于本次实验结果，下一步拟采用分子生物学技术，从EOS过度活化的角度出发，筛选出能影响EOS活化的趋化因子，进一步揭示鼻敏通窍方对儿童变应性鼻炎治疗的作用机理，开拓中医药防治小儿变应性鼻炎的新思路。