杞菊地黄口服液中熟地黄原料的质量控制

吴 芳， 罗定强， 樊宝娟， 杨海燕， 戴 涌， 刘海静

(陕西省食品药品检验研究院，陕西 西安 710061)

地黄为玄参科植物地黄RehmanmiaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根，性寒，重于清热凉血，养阴生津，经炮制成熟地黄后由寒转温，功效由清转补，重于补血滋阴、益精填髓[1]。现代研究表明，熟地黄具有其他多种药理作用[2-7]，生熟之品药性迥异。

目前，熟地黄炮制的温度、时间等工艺参数尚无严格的规定，实际生产过程中判定炮制是否完全及与生地黄进行区分主要依靠颜色、质地等感官指标，但熟地黄的质量控制必须依赖现代分析仪器及量化指标。2020年版《中国药典》收载的大约130个中药制剂中含有熟地黄，但仅有少数在其检验项目列入了显微鉴别和薄层色谱鉴别。近年来，研究熟地黄化学成分[8-11]及其含量动态变化[12-15]的报道较多，但尚未见制剂中熟地黄原料的报道，本实验参考文献[11-12]模拟熟地黄的炮制过程，选择甘露三糖、水苏糖作为指标成分，测定了部分饮片及杞菊地黄口服液中两者含量，以期为该药材质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，配置Alltech ELSD 3300 ES 蒸发光散射检测器，购自美国Waters公司；BP211D、BS224S电子分析天平，购自德国赛多利斯公司；KQ-500DE超声波清洗仪，购自昆山市超声仪器有限公司；高速匀浆机，购自德国IKA公司。

1.2 试剂 水苏糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号112031-201701，纯度90.5%)；甘露三糖对照品(上海同田生物技术有限公司，CAS号13382-86-0，E-2856，以98.0%计)。生地黄、熟地黄对照药材(中国食品药品检定研究院，批号分别为121180-201105、121196-201105)。水为高纯水；乙腈为色谱纯(美国Avantor Penformance Materials公司)。

1.3 药物与药材 65批杞菊地黄口服液来自市场；按照处方和工艺，使用合格饮片自制的阳性样品1批、不含熟地黄的阴性样品1批；生地黄饮片(编号生地黄1～生地黄7)、熟地黄饮片(编号熟地黄1～熟地黄8)购自连锁药店及市场。鲜地黄采自陕西西安长安区，经陕西省食品药品检验研究院罗定强主任药师鉴定为玄参科植物地黄RehmanmiaglutinosaLibosch.的块根，切片，缓缓烘焙至八成干，按炮制规范要求加热蒸制，蒸制过程中每隔4 h取样1次，共8次。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Carbohydrate色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，PN 840300-908)；流动相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～5 min，90%A；5～65 min，90%～65%A)；体积流量0.8 mL/min；柱温35 ℃；蒸发光散射检测器；漂移管温度95 ℃；气体体积流量3.0 L/min。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 取甘露三糖、水苏糖对照品适量，加水制成质量浓度分别为0.806 5、1.945 8 mg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取炮制品适量，粉碎成粗粉，精密称取2 g，置于锥形瓶中，精密加入50 mL水浸泡1 h，高速匀浆机处理1 min后超声提取30 min，离心，取上清液，即得(必要时进行稀释)。另取口服液、自制阳性样品、不含熟地黄的阴性样品适量，摇匀，各精密量取3 mL(含熟地黄约1.95 g)，加水至10 mL，摇匀，滤过，即得。

2.3 专属性试验 吸取“2.2”项下供试品溶液各5 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，阴性样品色谱图中在甘露三糖、水苏糖对照品色谱峰保留时间一致的位置上未发现色谱峰，表明该方法专属性良好。

1.甘露三糖 2.水苏糖

2.4 线性关系考察 分别称取甘露三糖、水苏糖对照品41.15、107.50 mg，置于10 mL量瓶中，加水制成质量浓度分别为4.032 7、9.728 8 mg/mL的对照品溶液，稀释成系列质量浓度，在“2.1”项色谱条件下各进样5 μL测定。以峰面积对数值为纵坐标(Y)，对照品质量浓度的对数值为横坐标(X)进行回归，得到甘露三糖、水苏糖方程分别为Y=1.20X+5.98(r=0.999 8)、Y=1.08X+6.11(r=0.999 9)，分别在0.161 3～4.032 7、0.389 2～9.728 8 mg/mL范围内线性关系良好。另外，两者检测限分别为0.18、0.22 mg/mL。

2.5 精密度试验 取甘露三糖、水苏糖质量浓度分别为0.806 5、1.945 8 mg/mL的对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得两者峰面积RSD分别为2.6%、2.7%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取熟地黄(编号5)适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得甘露三糖、水苏糖含量RSD分别为3.0%、3.5%；取口服液(批号170701)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得两者含量RSD分别为0.20%、2.5%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

2.7.1 熟地黄 取熟地黄(编号5)适量，粉碎成粗粉，精密称取6份，每份1 g，精密加入对照品溶液(甘露三糖、水苏糖质量浓度分别为197.098、13.325 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 熟地黄中各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.7.2 杞菊地黄口服液 精密量取口服液(批号170701)1.5 mL，精密加入对照品溶液(甘露三糖、水苏糖质量浓度分别为2.927、1.042 mg/mL)各1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 杞菊地黄口服液中各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.8 样品含量测定 地黄饮片中甘露三糖、水苏糖含量测定结果见表3，可知65批口服液中两者质量分数范围分别为0～4.04、0～10.2 mg/mL。

表3 各成分含量测定结果

4 讨论

熟地黄炮制时要求反复蒸晒[8]，直至“色黑如漆，味甘如饴”[16]。本实验结果显示，炮制可使水苏糖含量逐渐降低，甘露三糖含量逐渐升高，同时颜色由黄棕色逐渐加深变黑，味道甜度增加，当蒸制约20 h时，熟地黄表面及断面呈乌黑色，柔软有光泽，黏性大，按法定标准检验符合规定，此时水苏糖、甘露三糖含量比值约为0.1。7批生地黄中水苏糖、甘露三糖含量比值约为4.6～11.4，仅有1批小于5.0，其断面颜色为黑棕色，其余均大于7；8批熟地黄中两者比值为0.06～0.29，仅有1批大于0.20，其较大块的断面可见少量黄心，可能炮制不完全。

熟地黄饮片质韧软黏，不易粉碎成细粉。本实验对比了粉碎成粗粉再高速匀浆处理、直接粉碎以及冷冻后粉碎3种处理方法，结果第1种方法简便，易操作，各成分含量较高，重复性好，故选择其作为供试液的制备方法。

甘露三糖为熟地黄中特有的活性成分，在炮制过程中由水苏糖转化而来[16]，含量较高，药效确切。本实验证明了依据甘露三糖、水苏糖的含量及其比值为指标来判断炮制程度和区分生熟地黄，其结论与采用感观判断方法得到的结论相一致。

65批杞菊地黄口服液中，有12批未检出甘露三糖和水苏糖，提示该12批样品可能使用提取过有效成分的熟地黄药渣或者再生的熟地黄[17]进行投料；另外有16批样品中水苏糖的含量大于甘露三糖(两者比值为2.0～3.3)，提示熟地黄原料可能炮制不完全。研究结果表明，该制剂的质量标准需要进行提升。