桃儿七质量标准的研究

刘盈盈， 许显莉， 冯海生， 李彩霞*， 马世震*

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2.青海省青藏高原特色生物资源研究重点实验室，青海 西宁 810008；3.中国科学院大学，北京 100049)

桃儿七为小檗科植物桃儿七Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying的干燥根及根茎[1-5]，主要分布在我国青海、西藏、四川、陕西、甘肃等地，具有祛风除湿、活血止痛、祛痰止咳之功效[6-7]。现代药理研究还表明，桃儿七具有抗肿瘤、祛痰止咳、抗炎、抗病毒等作用[8-12]。桃儿七主要含有鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素等木脂素类化合物和槲皮素、山柰酚等黄酮类化合物，其中鬼臼毒素为主要活性成分，同时，鬼臼毒素是用于治疗各种恶性肿瘤抗癌药物依托泊苷(VP-16)和替尼泊苷(VM-26)的化学合成原料药[13-15]，研究发现，4′-去甲基鬼臼毒素对羊膜细胞培养的疱疹病毒有良好的抑制作用，此外，桃儿七中槲皮素和山柰酚等成分对镇咳祛痰显著效果。因此，桃儿七药材应用广泛，全面有效控制桃儿七药材质量具有重要意义。

目前，桃儿七药材尚无国家标准及地方标准。仅小檗科植物桃儿七Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying的干燥成熟果实在《中国药典》中以“小叶莲”之名收载，对其性状、显微特征进行了描述，采用TLC对鬼臼毒素进行了定性鉴别，规定了水分、总灰分含量限度[16]。张丽等[17]对10批桃儿七药材进行质量标准研究，对其植物形态、性状、显微特征进行描述，采用TLC法进行定性鉴别以及对4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、鬼臼毒素3种成分进行含量测定。对桃儿七药材质量标准的研究，尚未包括杂质、水分、总灰分、醇溶性浸出物含量等其他常规检查项，也未包含农药残留量、重金属及有害元素等安全性内容。近年来，中药材质量标准中有关安全性方面内容受到较大关注，2020年版《中国药典》主要特点之一就是提高药品安全和有效控制要求，进一步加强对药材饮片重金属及有害元素、禁用农药残留、真菌毒素以及内源性有毒成分的控制[16]。因此，现有桃儿七质量标准研究不能有效地控制桃儿七药材整体质量，还需进一步完善，补充安全检查项目。

本研究采用显微鉴别方法和薄层色谱法(TLC)对桃儿七药材进行鉴别，同时按2020年版《中国药典》(四部)方法对其杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属、农药残余量、醇溶性浸出物等进行考察；采用HPLC法对4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚、鬼臼毒素4种成分进行定量分析，以期制定桃儿七药材质量标准体系，为有效地控制桃儿七药材整体质量提供科学参考。

1 材料

1.1 药材 桃儿七经中国科学院西北高原生物研究所马世震研究员鉴定为正品，样本存放于中国科学院西北高原生物研究所藏药研究重点实验室。具体信息见表1。

表1 样品信息

1.2 仪器与试剂 SL-500A高速万能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂)；ML2047电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；BPG-9140A电热鼓风干燥箱(一恒科学仪器有限公司)；SK3310LHC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；N-1210BV-WB旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；荧光显微镜尼康CI-S(日本尼康公司)；Molatom 18220DXG超纯水系统(重庆摩尔水处理设备有限公司)；高效GF254预制薄层板(青岛海洋化工厂)；硅胶HF254预制薄层板(烟台化工厂)。鬼臼毒素对照品(纯度≥98%)(成都普菲德生物技术有限公司)；4′-去甲基鬼臼毒素对照品(纯度≥99.2%，中国食品药品检定研究院)；山柰酚对照品(纯度≥98%，成都普菲德生物技术有限公司)；槲皮素对照品(纯度≥98%，北京中科质检生物有限公司)。甲酸(色谱纯，天津市凯信化学工业有限公司)；甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公司)；二氯甲烷(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；硫酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；香草醛(西陇科学股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1 基源鉴别 通过野外标本采集，并借鉴《中国植物志》[18]进行描述。桃儿七是小檗科桃儿七属多年生草本，植株高20～50 cm；根状茎粗短，节状，多须根；茎直立，单生，具纵棱，无毛，基部被褐色大鳞片；叶2枚，薄纸质，非盾状，基部心形，3～5深裂几达中部，裂片不裂或有时2～3小裂，裂片先端急尖或渐尖，上面无毛，背面被柔毛，边缘具粗锯齿；叶柄长10～25 cm，具纵棱，无毛；花大，单生，先叶开放，两性，整齐，粉红色；萼片6，早萎。花瓣6，倒卵形或倒卵状长圆形，长2.5～3.5 cm，宽1.5～1.8 cm，先端略呈波状；雄蕊6，长约1.5 cm，花丝较花药稍短，花药线形，纵裂，先端圆钝，药隔不延伸；雌蕊1，长约1.2 cm，子房椭圆形，1室，侧膜胎座，含多数胚胎，花柱短，柱头头状；浆果卵圆形，长4～7 cm，直径2.5～4 cm，熟时桔红色；种子卵状三角形，红褐色，无肉质假种皮；花期5～6月，果期7～9月；以根及根状茎入药；秋季采挖，洗净晒干。

2.2 性状鉴别 通过野外标本采集，并借鉴《中国植物志》[18]进行描述。桃儿七根茎呈不规则结节状，长0.5～3 cm，直径0.5～1 cm，表面灰黄色、暗灰棕色或淡褐色，上面具数个稍膨大而凹窝不甚明显的茎基，旁边有一淡棕色干燥苞芽；质硬，折断面略平坦，淡黄棕色，隐约有一圈维管束小点；根密生，细长圆柱形，较顺直，长2.3～46 cm，直径1.2～4.0 mm,表面淡棕色至棕黄色，较光滑或具细纵皱纹和细根；质脆，易折断，断面黄白色，粉性，中心有一淡黄色小点；气微，味苦、微辛。

2.3 显微鉴别 取桃儿七粉末少许，置载玻片上，水合氯醛制片，于显微镜下观察，见图1。由此可知，本品淀粉粒众多，单粒类圆形，复粒由2～4分粒组成，少数5～9分粒；导管数个相聚或单个散在，大多为网纹，少数为孔纹、梯纹、螺纹。

注：A～F分别为淀粉粒、环纹导管、孔纹导管、梯纹导管、网纹导管、维束管。

2.4 薄层色谱鉴别 取药材粉末1 g，加入40 mL甲醇超声提取21 min，放冷，摇匀，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加5 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。

精密称取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg该成分的溶液，即得对照品溶液。

参照2020年版《中国药典》(四部)通则0502，吸取上述供试品及4种对照品溶液各2 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-水-甲酸(15∶1.2∶0.1∶0.1)为展开剂，在展开缸中预饱和30 min后展开，取出，在105 ℃下烘干，254 nm紫外光检视，见图2。

注：1～10为不同产地桃儿七，11为4′-去甲基鬼臼毒素对照品，12为鬼臼毒素对照品，13为槲皮素对照品，14为山柰酚对照品。

2.5 检查

2.5.1 杂质 按照2020年版《中国药典》(四部)通则2301项测定，结果见表2，可知10批药材杂质范围为1.19%～4.98%，平均为3.13%。因此，暂将杂质限度定为不得超过4.00%。

2.5.2 水分 按照2020年版《中国药典》(四部)通则0832项第二法测定，取供试品粉末2～5 g，平铺于干燥至恒定质量的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，疏松品不超过10 mm，精密称定质量，开启瓶盖，在100～105 ℃下干燥5 h，瓶盖盖好，移到干燥器中，放冷30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，放冷，称定质量，至连续2次质量差异不超过5 mg为止，根据减失的质量计算含水量，结果见表2，可知10批药材水分范围为5.28%～8.46%，平均为7.24%。以平均值的变差系数20%核算，确定水分不得超过9.00%。

2.5.3 灰分 按照2020年版《中国药典》(四部)通则2302项第二法测定，取供试品粉末3～5 g，置炽灼至恒定质量的坩埚中，称定质量(准确至0.01 g)，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时逐渐升高温度至500～600 ℃，使完全灰化并恒定质量，根据残渣质量计算总灰分含量。取所得灰分，在坩埚中小心加入稀盐酸约10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 mL冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸过滤，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣与滤纸移到同一坩埚中，干燥，炽灼至恒定质量，根据残渣质量计算酸不溶性灰分的含量，结果见表2，可知10批药材总灰分含量范围为2.20%～4.50%，平均为3.57%；酸不溶性灰分含量范围为0.25%～1.96%，平均为0.89%。以平均值的变差系数20%核算，拟定总灰分含量不得超出4.00%，酸不溶性灰分含量不得超过1.00%。

表2 杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物含量测定结果

2.5.4 重金属及有害元素 2020年版《中国药典》(四部)通则2321项下规定了铅、镉、砷、汞、铜检测方法，故选定此5种重金属进行含量测定。采用原子吸收分光光度法，铅、镉均采用石墨炉法进行测定，砷采用氢化物法进行测定，汞采用冷蒸汽吸收法进行测定，铜采用火焰法进行测定，结果见表3,可知10批药材铅含量为0.24～1.16 mg/kg，镉含量为0.011～0.054 mg/kg，砷含量为0.077～0.53 mg/kg，汞含量为0.000 9～0.005 5 mg/kg，铜含量为5.33～14.53 mg/kg，平均值分别为0.69、0.037、0.247、0.002 7、8.17 mg/kg。2020年版《中国药典》(四部)规定，铅不得超过5 mg/kg，镉不得超过1 mg/kg，砷不得超过2 mg/kg，汞不得超过0.2 mg/kg，铜不得超过20 mg/kg，本实验10批药材五者含量均在上述范围内。

表3 重金属及有害元素含量测定结果

2.5.5 农药残留量 由于桃儿七病虫害主要是蚜虫和田鼠[19]，故选取常用于防治蚜虫的农药马拉硫磷、杀螟硫磷、抗蚜威、溴氰菊酯、甲氰菊酯进行农药残留量测定。按照2020年版《中国药典》(四部)通则2341项下方法检测，结果5种农药均未检出。2020年版《中国药典》(四部)通则2321项下规定，农药残留量不得超过0.01 mg/kg，故拟定桃儿七5种农药残留量亦然。

2.6 浸出物检查 取10批药材粉末适量，精密称定，按2020年版《中国药典》(四部)通则2201项下醇溶性浸出物测定法(热浸法)测定，结果见表2，可知10批药材醇溶性浸出物含量为4.04%～10.99%，平均为6.34%，以平均值的变差系数20%核算，拟定浸出物含量不得少于5.00%。

2.7 含量测定

2.7.1 色谱条件 JADE-PAK ODS色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.04%甲酸(B)，梯度洗脱(0～5 min,5%～25%A；5～15 min，25%～28%A；15～30 min，28%A；30～40 min，28%～45%A；40～60 min，45%～70%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。在该条件下各色谱峰分离情况良好，见图3。

1.4′-去甲基鬼臼毒素 2.槲皮素 3.山柰酚 4.鬼臼毒素

2.7.2 对照品溶液制备 精密称取鬼臼毒素、4′-去甲基鬼臼毒素、山柰酚、槲皮素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1、0.5、0.1、0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 供试品溶液制备 精密称取药材干燥粉末0.1 g，过40目筛，置于具塞试管中，在料液比1∶40、超声时间21 min、超声温度56 ℃、82%甲醇下提取，共3次，抽滤得提取液，定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.7.4 线性关系考察 吸取“2.7.2”项下对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，在“2.7.1”项色谱条件下进样2、4、6、8、10、12、14、16 μL。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)进行回归，结果见表4，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系

2.7.5 精密度试验 精密吸取“2.7.2”项下对照品溶液10 μL，在“2.7.1”项色谱条件下进样5次，测得4种成分峰面积RSD分别为0.20%、0.39%、0.26%、0.21%，表明仪器精密度良好。

2.7.6 重复性试验 取同一批药材(S1)6份，每份约0.1 g，精密称定，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.7.1”项色谱条件下进样，测得4种成分含量RSD分别为1.07%、2.00%、1.86%、3.00%，表明该方法重复性良好。

2.7.7 稳定性试验 取同一批药材(S1)约0.1 g，精密称定，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、 12、24 h在“2.7.1”项色谱条件下进样，测得4种成分峰面积RSD分别为0.52%、0.96%、0.86%、0.42%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7.8 加样回收率试验 取各成分含量已知的药材(S1)9份，每份约0.1 g，精密称定，按样品含量-对照品量1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例分别加入各对照品溶液，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.7.1”项色谱条件下进样，计算回收率，结果见表5。

表5 各成分加样回收率试验结果(n=9)

2.7.9 样品含量测定 取10批药材提取物，平行3组，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.7.1”项色谱条件下进样，计算含量，结果见表6。由此可知，4种成分含量差异较大，可能是受植物生长环境及采集时间的影响；鬼臼毒素含量最高，故以其为指标成分，拟定含量不得少于2.80 mg/g。

表6 各成分含量测定结果(mg/g)

3 讨论

3.1 TLC条件筛选 《中国药典》中小叶莲TLC鉴别方法采用环己烷-水饱和的正丁醇-甲酸(6.5∶2.5∶0.8)的上层溶液为展开剂，但只针对一种成分。张丽等[17]采用氯仿-甲醇(15∶1)下层液为展开剂展开，也只针对3种成分。本实验比较了不同的展开剂系统、不同点样量、不同检视方法下的色谱，同时，采用3个不同厂家的薄层板对此方法的耐用性进行了考察，发现在不同的薄层板上4种成分的斑点均可达到有效分离，表明该方法耐用性强。综合实验结果分析，最终确定TLC展开条件。

3.2 浸出物测定方法考察 本实验先采用冷浸法，分别使用8种不同溶剂测定桃儿七浸出物含量，发现使用50%乙醇浸出物含量最高。然后，将50%乙醇作为溶剂，对比热浸法和冷浸法不同方法下桃儿七浸出物含量，发现热浸法条件下浸出物含量较高。因此，选择热浸法，并以50%乙醇作为溶剂，对10批桃儿七进行浸出物含量测定。

3.3 色谱条件选择 本实验前期发现4′-去甲基鬼臼毒素、槲皮素、山柰酚和鬼臼毒素的最大吸收波长均不同，因此，比较不同波长下的色谱图，为最大可能的兼顾4种成分的峰形及灵敏度，试验最终选择254 nm为检测波长[20]。选择了不同比例及组合的流动相，通过比较色谱图中各成分峰形情况，最终确定乙腈-0.04%甲酸水为流动相，梯度洗脱，这一与叶耀辉等[21]的研究结果一致。

3.4 含量限度确定 本研究中，鬼臼毒素含量2.881～62.548 mg/g，平均值25.768 mg/g，含量差异较大，这可能是由于药材的不同生长年限及不同的生长发育环境[22]。李运等[23]在甘肃产马尾连药材的质量标准研究中，由于马尾连中盐酸小檗碱含量范围差异较大，故以最低盐酸小檗碱含量设为含量限度。因此，本实验也以鬼臼毒素最低测定值为含量限度，即不得少于2.80 mg/g。

4 结论

本实验建立了桃儿七药材中4种成分的TLC鉴别方法，方法简便易行，结果可靠，并对10批不同产地的桃儿七药材进行了杂质、水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属及有害元素、农药残留量、醇溶性浸出物检测及4种成分含量测定，初步完成了桃儿七的质量标准研究，以期为科学制定桃儿七的药材质量标准提供借鉴，利于有效控制桃儿七药材品质。