时间分辨荧光免疫层析法定量检测粮谷中重金属铅的研究

蒋 雁，张居清，朱亚俊，于 婷，杨婷婷,*

1.贵州省粮油产品质量监督检验站 (贵阳 550001)2.盱眙金谷粮食集团有限公司 (盱眙 211700)3.江苏省苏微微生物研究有限公司 (无锡 214063)

随着我国工业的飞速发展，工业“三废”、粮食种植过程中大量农药、化肥的使用以及粮食的的生产加工过程，都会直接或间接地对粮食带来重金属污染，从而对粮食质量安全也造成严重的危害。粮食中重金属铅的污染主要存在于玉米、小麦及水稻中。长期食用被铅污染的粮食，造成人体内重金属铅的富集，对神经系统、骨骼造血机能、消化系统、生殖系统等均有危害。特别是大脑处于神经系统发育敏感期的儿童，很容易造成儿童发育迟缓等不良后果[1-2]。我国食品安全国家标准GB 2762—2017中关于谷物中铅的限量标准为0.2 mg/kg。但是粮食谷物中铅超标的现象时有发生，因此研究粮食谷物中铅的检测方法意义重大。

重金属铅的常规检测方法[3-8]检出限低、准确度高，但是设备昂贵，前处理繁琐耗时，试样需进行消解，对人员素质要求较高，不能满足基层检测单位现场快速检测的要求。因此，迫切需要建立一种快速、方便、准确和低成本的可实现批量样本快速筛查的检测方法，从而满足粮食收购过程监控、现场监督、检查的工作需要。免疫分析法与上述几种分析方法相比具有操作简便、特异性好、分析检测成本低廉的优点，目前已报道的免疫分析方法大多采用胶体金试纸条或者ELISA法[9-10]。本研究室前期已开发了重金属镉的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，该方法检测谷物中的重金属镉，样品前处理简单、快速，与传统仪器法测定相比安全系数较高。在此基础上，再次开发重金属铅的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡，用于粮食谷物中铅的快速定量测定。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

SW-2型时间分辨荧光检测仪，江苏省苏微微生物研究有限公司；GL-21M型高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；HS-3型垂直混匀仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；JP-100T型超声机，深圳市洁盟清洗设备有限公司；BPG-9240A型精密鼓风干燥箱，上海精科实业有限公司；HM3035型三维划膜喷金仪，CTS300型数控裁条机，ZQ2000型自动斩切机，上海金标生物科技有限公司。

1.2 试剂与材料

碳二亚胺(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)，Sigma-Aldrich公司；乙二胺四乙酸(EDTA)，上海百灵威公司；Pb-EDTA-BSA偶联物、抗Pb-EDTA单抗，本研究室自研；羊抗鼠IgG，上海杰一生物有限公司；铕Eu3+纳米微球，平均粒径200 nm，长沙美牛生物科技有限公司；硝酸纤维素膜CN140，德国赛多利斯；样品垫，SB08，上海金标生物科技有限公司；吸水纸，SX27，上海金标生物科技有限公司；PVC底板，SM31-25，上海金标生物科技有限公司；重金属铅标准溶液(1 000 μg/mL)、有证标准物质GBW(E)100377糙米粉、(GBW(E)100379全麦粉，北京北方伟业计量技术研究院；其他样品由江苏省粮油质量检测中心提供(通过ICP-MS定值)。

1.3 实验方法

1.3.1抗Pb-EDTA单抗的荧光纳米微球标记

将铕Eu3+纳米微球超声分散10 min后，取出100 μL于2 mL 圆底离心管中，加入900 μL超纯水混匀，并超声分散5 min。分别配制50 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与碳二亚胺(EDC)的乙醇溶液，各取50 μL加入上述混合液中，混匀后于垂直混匀仪上室温旋转混匀40 min，15 000 r/min离心20 min，去除上清液，加入1 mL超纯水，超声5 min使微球分散。于活化后的微球悬液中加入0.05 mg抗Pb-EDTA单抗，置于垂直混匀仪上室温反应2 h，加入BSA使之最终浓度为0.5%，封闭1 h，15 000 r/min离心20 min，去除上清液，加入1 mL复溶液超声分散后2 ℃～8 ℃冷藏备用。

1.3.2荧光免疫试纸条的组装

通过实验条件筛选，确定最佳包被抗原、羊抗鼠IgG的工作浓度以及荧光抗体的工作浓度。用三维划膜喷金仪将包被抗原和羊抗鼠IgG分别包被于NC膜上，形成检测线(T)和质控线(C)。将一定浓度的荧光标记抗体喷涂于结合垫上，上述NC膜和结合垫于45 ℃鼓风干燥箱中干燥24 h以上。以PVC胶粘板作衬板，将层析膜粘贴在衬板的中央。将样品垫、结合垫、吸水纸分别粘贴在层析膜的两端，并且两垫之间有1～2 mm的交联。将组装好的试纸条大板用自动斩切机切割成宽4 mm、长60 mm的板条，装于塑料卡壳中，用压壳机压紧。放入带干燥剂的铝箔袋中，连续封口机封口后，常温保存。

1.3.3检测原理

重金属Pb时间分辨荧光免疫层析定量检测卡应用竞争抑制免疫层析的原理，样本中若含有重金属Pb，会先与样品稀释液中的EDTA形成螯合物(即Pb-EDTA)，在侧向移动的过程中会与荧光微球标记的特异性单克隆抗体反应，从而抑制抗体和NC膜检测线(T)上的抗原(Pb-EDTA-BSA偶联物)的结合。随着样本中Pb含量的升高，结合于检测线上的抗体量减少，相应的检测线荧光强度也随之变弱。使用专用时间分辨荧光免疫层析检测仪读数，可定量的测出样本中Pb的含量。

1.3.4标准曲线的建立

配制0.01 mol/L的pH为7.2的磷酸盐缓冲液，加入0.5%的吐温-20和1 mg/L的EDTA，以此作为样品稀释液，将Pb标准品1 000 μg/mL 用上述样品稀释液定容配制成1 000 ng/mL的标准储备溶液；再逐步稀释成浓度分别为0、1、2、4、8、16 ng/mL的标准工作溶液。分别取100 μL加至试纸条的样品孔中，室温(25 ℃±5 ℃)下反应10 min，由低浓度到高浓度进行检测，采用时间分辨荧光仪检测T线与C线荧光强度，计算T/C值。以标准工作溶液浓度的自然对数值(lnC)为横坐标，各浓度标准液的T/C值与0 ng/mL标准液的T0/C0值的比值所得百分比为纵坐标，建立标准曲线。

1.3.5样品前处理

准确称1.0 g粉碎均匀样本至15 mL离心管中，量取5 mL 1 mol/L的稀硝酸溶液，至漩涡混匀器上涡旋提取3 min，于离心机中4 000 r/min离心5min，得上清液。移取100 μL上清液于1.5mL离心管中，加入200 μL 0.5 mol/L 的NaOH溶液，至漩涡混匀器上涡旋混匀，吸取100 μL上述混匀液于1.5 mL离心管中，再加入400 μL样品稀释液至其中，至漩涡混匀器上涡旋混匀，1 min内待检。

1.3.6方法的技术参数

(1)灵敏度

(2)检出限与定量限

(3)准确度

准确度依据与标准样品标定值的检测偏差判定，用正确度表示。采用有证标准物质，分别根据步骤1.3.5和1.3.4进行处理和检测，平行测定不低于6次。根据时间分辨荧光分析仪测得的T/C值，由标准曲线得出检测浓度，按公式(1)计算准确度：

正确率=检测均值/样本标定值×100%

(1)

(4)精密度

精密度依据批内精密度，指同一批次产品检测同一样本结果的重复性，用变异系数(CV)表示，根据公式(2)计算。采用有证标准物质，具体步骤同1.3.6中准确度测定的(3)方法。根据所得测定结果，计算变异系数(CV值)。

变异系数(CV)=标准差/检测均值×100%

(2)

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

图1为建立的重金属Pb的标准曲线。从中可看出，在1～16 ng/mL浓度范围内，有效剂量值即抑制率在93.2%～37.3%，线性回归相关系数R2达0.996 9，直线方程y=-0.221 1x+0.922 7。由此，确定标准曲线的线性范围，并以此作为以下试验的线性浓度。

图1 重金属Pb的标准曲线

2.2 方法的技术参数

2.2.1灵敏度

表1 重金属Pb灵敏度的测定

2.2.2检出限与定量限

通过测定20份阴性稻谷样本，通过计算得出该方法的检出限为8.70 μg/kg，定量限为22.39 μg/kg，具体测定结果见表2。

2.2.3准确度

采用有证标准物质，按照步骤检测，测定结果如表3所示，可见回收率在93.2%～104%之间，变异系数(CV)均在15%以下。

表3 重金属Pb准确度的测定(n=6)

2.2.4精密度

采用同一批次层析卡，分别测定高、中、低三个浓度的重金属Pb标准品，通过测定值计算得出的变异系数在3.6%～6.2%之间，说明精密度良好。

表4 重金属Pb精密度的测定(n=10)

3 结论

本研究在前期重金属镉的时间分辨免疫荧光层析定量检测卡研究基础上，开发了重金属铅的时间分辨免疫荧光层析定量检测，与传统仪器法测定相比，该检测方法样品前处理简单、快速，操作安全性更高。对所建立的方法进行了一系列参数优化，该方法的检出限和定量限分别为8.70 μg/kg和22.39 μg/kg，对有证标准物质的检测回收率在93.2%～104%之间。

所建立的时间分辨免疫荧光试纸条操作简单，样本处理过程只需稀酸简单提取和稀释后即可测定，整个操作过程大约需要20 min，配套小型经济、便携的荧光分析仪，非常适合基层单位，便于大量样本的快速初步筛查，从而满足粮食收购过程监控、现场监督、检查的工作需要。