重组大肠杆菌表达豹蛙酶发酵培养基和发酵条件的优化

夏 祯， 赵兴聪， 王学东

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）

豹蛙酶(Ranpirnase），商品名Onconase（ONC)，是全球正在研究的多种药物之一[1-2]，最早分离自北极豹蛙(Northern Leopard Frog，Rana pipiens)的卵母细胞和早期胚胎[3]，属于核糖核酸酶A(RNase A)超家族成员，是已知的胰核糖核酸酶超家族成员中最小的单结构域蛋白。它是由104 个氨基酸残基组成的一个相对分子质量为11835、等电点为9.7 的蛋白质。豹蛙酶能特异性地降解tRNA 抑制蛋白质的合成[4]，细胞毒性较强, 可通过多种机制导致肿瘤细胞凋亡[5]，在体内外对多种肿瘤细胞均具有显著的杀伤作用[6-7]。临床上豹蛙酶作为抗肿瘤药物用于治疗恶性间皮瘤，也用于非小细胞肺癌和其他固体肿瘤的治疗并处于临床研究阶段，有着很大的应用前景[8]。为了提高重组蛋白的表达水平，有必要对培养基和表达条件进行优化[9]。目前，对于发酵培养基的优化已有许多研究，其中代志凯等[10]对近年来常用的试验设计和优化方法进行了综述。于子玲等[11]用Plackett-Burman 实验设计和Box-Behnken响应面分析方法优化了辅酶Q10 产生菌的发酵培养基。朱新术等[12]对重组毕赤酵母表达木聚糖酶的发酵培养基进行了优化，木聚糖酶的酶活力和比酶活分别达到了原来的3.055 倍和3.889 倍。本文通过对含有豹蛙酶基因的重组大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC 进行培养、优化诱导条件，并且利用Plackett-Burman (PB)实验设计考察多个因素对豹蛙酶表达的影响，从而确定出最优的培养方案，以提高豹蛙酶的表达量[13]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 重组菌E. coliBL21 (DE3)-pET- 22b (+)-ONC（豹蛙酶的NCBI 编号为P22069，基因序列为全基因合成。菌株为本实验室构建保存菌株）。

1.1.2 试剂 酵母粉（Yeast Extract）：安琪酵母股份有限公司；蛋白胨（Tryptone）：瑞轩生物制品公司；葡萄糖和培养基用无机盐：国药集团化学试剂有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)：上海国药生物技术有限公司。文中所用试剂均为分析纯。

1.1.3 培养基 种子培养基：Luria-Bertani (LB)培养基。发酵培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，葡萄糖1，NaCl 5，Na2HPO41，KH2PO42.65，MgSO42，pH 7.2；培养基115 ℃灭菌30 min。补料培养基（g/L）：葡萄糖640；蛋白胨78，酵母粉10.78；115 ℃ 灭菌30 min。

1.2 实验方法

1.2.1 重组菌的培养和蛋白表达 将重组菌E. coliBL21 (DE3)-pET-22b (+)-ONC 接入4 mL 的LB 培养基（含100 μg/mL 的氨苄青霉素）中，37 ℃摇床培养8 h 活化种子。将活化后的种子液按2.5%的接种量接种到发酵培养基（含100 μg/mL 的氨苄青霉素）中，37 ℃、200 r/min 摇床培养一定时间后加入一定浓度的IPTG 进行诱导表达，继续培养8 ～10 h。

1.2.2 诱导条件优化 应用单因素实验考察诱导剂浓度、诱导温度、诱导前培养时间对重组大肠杆菌表达豹蛙酶的影响[14]。

1.2.3 Plackett-Burman 法 优 化 重 组 菌 表 达 豹 蛙 酶 发酵培养基 Plackett-Burman 法是一种两水平部分析因设计，可以利用少量的实验筛选多个变量。并通过统计分析筛选出众多因素中对实验结果有显著影响的因素，也可以不断缩小因素的最优值范围，达到同时粗略优化考察因素的作用[15]。

1.2.4 重组菌蛋白表达水平的确定 取发酵液50 mL于4 ℃、10 000 r/min 条件下离心20 min 收集菌体。弃去上清，沉淀中加入适量缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl ，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）重悬菌体，4 ℃下超声破壁，然后于4 ℃、10 000 r/min 条件下离心40 min收集沉淀和上清，分别进行SDS-PAGE 分析，通过凝胶扫描成像仪分析电泳结果，得到目的蛋白占总蛋白的比例，即蛋白表达水平。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 诱导温度对蛋白表达的影响 合适的诱导温度既能保证微生物的正常生长，又能使外源基因得到正确的（可溶性）表达。将重组大肠杆菌置于37 ℃摇床下培养4 h，加入终浓度0.2 mmol/L 的IPTG，随后分别置于25～37 ℃不同温度的摇床中培养10 h，取样测定各温度下的菌浓，并按照蛋白表达量测定的方法考察重组大肠杆菌表达豹蛙酶的表达水平。结果发现降低诱导培养温度并不能提高可溶性表达量，蛋白主要以包涵体形式存在，而且降低温度不利于重组菌的生长以及豹蛙酶表达。如图1 所示，在诱导温度37 ℃时，重组菌表达豹蛙酶的表达水平更高，达到8.3%，菌体密度也较高，OD600达到了4.80，所以设定大肠杆菌一般性的最适培养温度37 ℃用于重组菌的后续实验中。

图1 诱导温度对重组菌生长以及表达豹蛙酶的影响Fig. 1 Effect of induction temperature on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.2 诱导剂浓度对蛋白表达的影响 增加诱导剂IPTG 浓度可以提高诱导强度，提升蛋白表达水平，但同时对微生物细胞具有一定的毒性[16]，因此，诱导剂合适的添加浓度对重组蛋白表达非常重要。将重组大肠杆菌在37 ℃摇床培养4 h，然后分别向摇瓶中添加终浓度范围为0.1～1.2 mmol/L 的IPTG，并且于37 ℃ 继续培养10 h，分别取样测定其菌浓和豹蛙酶的表达水平，结果如图2 所示。随着诱导剂浓度的升高，豹蛙酶的表达水平总体上表现为先增后减的趋势，而菌体生长总体上则呈现逐步增加的抑制效果。实验结果表明当IPTG 终浓度在0.9 mmol/L 时表达水平最高，可达到11.6%。但是在此条件下的细胞生长水平则比较差；而在IPTG 终浓度0.2 mmol/L的条件下细胞有一个适中的表达水平，同时该终浓度对细胞生长无明显抑制；从重组菌的生长情况、表达情况与成本方面综合考虑，最终选择0.2 mmol/L为后续实验中IPTG 的终浓度。

图2 诱导浓度对重组菌生长以及表达豹蛙酶的影响Fig. 2 Effect of induction concentration on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.1.3 诱导前培养时间对蛋白表达的影响 因为IPTG 对菌体生长和蛋白表达有双重影响，所以诱导剂加入的时机是影响总的菌体蛋白表达的重要影响因素。将重组大肠杆菌置于37 ℃摇床下培养不同时间后分别加入终浓度为0.2 mmol/L 的IPTG 诱导剂，继续诱导培养10 h，分别取样测定各实验组的菌浓和豹蛙酶的表达水平，结果如图3 所示。随着诱导前培养时间的增加，重组菌表达豹蛙酶的表达水平总体上呈现先增后减的趋势，而菌浓则总体上稍有上升。诱导前培养3 h，表达水平最高可达9.4%。这是因为在1～3 h，重组菌进入生长对数期，此时菌体活力较强，诱导对重组菌表达较好。所以选择3 h 作为后续实验的诱导前培养时间。

图3 诱导前培养时间对重组菌生长以及表达豹蛙酶的影响Fig. 3 Effect of culture time before induction on the growth and expression of ranpirnase of recombinant E. coli

2.2 Plackett-Burman 法优化的发酵培养基结果

在上述最适培养和诱导条件下，进一步优化重组大肠杆菌表达豹蛙酶的最优培养基组成。实验采用Plackett-Burman 设计方法，筛选对重组大肠杆菌表达豹蛙酶(菌体总密度及豹蛙酶的表达量)影响最为显著的发酵培养基成分因素[17]。采用葡萄糖、甘油、蛋 白 胨、酵 母 粉、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、ZnSO4、CaCl2、(NH4)2SO4、MnSO4、FeCl3、CoCl2、CuSO4、Na2B4O7作为Plackett-Burman 实验的研究因素，考察了上述因素对菌体量和豹蛙酶表达水平的影响情况。经过预实验最终从上述因素中选取了12 个因素和2 个虚拟变量进一步考察它们对重组菌表达豹蛙酶的影响(表1)，并得到结果(表2)进行后续的数据分析。

表1 Plackeet-Burman 实验设计因素水平表Table 1 Levels of selected factors for Plackeet-Burman

表2 Plackeet-Burman 实验设计及结果Table 2 Experimental design and results of Plackeet-Burman

续表2

数据结果采用实验设计软件Design-Expert 进行回归方程分析，得到各影响因素的效应值(F值)以及显著性(Prob>F值)（表3）。效应值可用来反映各个考察因素对于整体的影响。效应值越大则表示该因素对于整体的影响越大，而效应值越接近零则表明该因素对于整体的影响越小。各因素的显著性由Prob>F来决定。当Prob>F的值小于0.05 时表示该因素的效果显著(置信区间选择95%)，当Prob>F的值大于0.1 时则表示这个因素的效果不显著。因此，当通过Plackett-Burman 实验筛选影响因素时，既要考虑因素的效应值也要考虑因素显著性。

表3 Plackett-Burman 实验回归分析结果Table 3 Regression analysis results of Plackett-Burman design

根据实验数据分析可知，在实验选取的浓度范围内，Zn2+、Mn2+、Mg2+、NaCl、Ca2+、KH2PO4、蛋白胨对重组大肠杆菌表达豹蛙酶的总蛋白量有显著影响。通过Plackett-Burman 实验确定了影响重组菌表达豹蛙酶的显著因素以及影响因素最适的大致范围，但由于因素之间关联性不强，所以没有再进一步进行响应面优化实验，而是综合几次Plackett-Burman实验结果确定最优培养基组成（g/L）为：蛋白胨10，酵母粉4，葡萄糖1，(NH4)2SO45，NaCl 15，Na2HPO41.6，KH2PO44 ，MgSO44 ，CaCl20.5 ，MnSO40.2，Fe2(SO4)30.3，ZnSO40.3。

用上述优化的发酵培养基进行摇瓶实验验证，结果见图4。采用凝胶扫描成像仪分析电泳结果，可知豹蛙酶表达水平由优化前的9%提高到优化后的36%，采用分光光度计测得OD600值由优化前的4.80 提升到优化后的5.47，可见蛋白表达水平和菌体生长情况都得到了改进。

图4 摇瓶水平上优化前后重组菌表达豹蛙酶情况Fig. 4 Expression of ranpirnase in recombinant E. coli before and after optimization at shake flask level

2.3 发酵罐试验结果

为得到大量的重组豹蛙酶，并验证摇瓶水平所得重组菌表达条件的优化结果，在7 L 发酵罐中进行了发酵表达试验。使用优化后的发酵培养基和诱导条件，接种量为2%。接种后，根据实际的溶氧变化控制搅拌转速、空气通量使溶氧保持在20%以上，发酵过程中自动调节pH，使其保持在7.0[18]。前期菌体生长阶段采用指数补料方式，补料速率根据菌体的生长状况实时调整，待菌体浓度达到OD600=20 时，加入终浓度0.2 mmol/L 的IPTG 诱导表达，诱导阶段采用pH-stat 的控制方式[19-20]，再在37 ℃下诱导培养9～10 h，收集发酵液，SDS-PAGE 电泳测定豹蛙酶的表达量，结果见图5。观察全细胞、细胞破碎后上清液、细胞破碎后沉淀电泳结果可知，豹蛙酶主要以包涵体形式存在，其中包涵体占95%以上。优化后发酵罐中重组菌对豹蛙酶的表达水平可达到55%，摇瓶水平上的优化得到了很好的验证。除表达水平外，重组菌在优化后的发酵培养基中的生长更好，采用分批补料发酵能够获得更高的的菌浓，OD600提高到35，且菌体易于离心、不易自溶，更加稳定。

图5 发酵罐水平优化后重组菌表达豹蛙酶情况Fig. 5 Expression of ranpirnase by recombinant E.coli after optimization of fermentor

3 结 论

通过单因素实验对豹蛙酶表达的诱导温度、诱导剂浓度以及诱导前培养时间进行优化，综合实验结果并考虑生产成本最终确定诱导温度为37 ℃，诱导剂浓度为0.2 mmol/L，诱导前培养时间为3 h。通过Plackett-Burman 法优化了发酵培养基，在摇瓶水平上豹蛙酶表达量由优化前的9%提高到优化后的36%，OD600值由优化前的4.80 提升到优化后的5.47。以此为基础，在7 L 发酵罐上采用分批补料方式进行重组豹蛙酶发酵表达，表达水平可达到55%，OD600值可达到35。优化结果对重组菌生产豹蛙酶的工业应用有很好的借鉴作用。