南方红豆杉水提物对TGF-β 诱导的NCI-N87 细胞上皮间质转化的影响

邹媛媛

（杭州市萧山区中医院消化内科 浙江 杭州 312000）

胃癌是常见恶性肿瘤之一，发病率居高不下。最近的国家癌症中心数据显示，胃癌在男性恶性肿瘤中发病排第2 位，女性第5 位，预后相对差，整体病死率位列第3 位[1]。南方红豆杉已被证明[2]，可抑制致癌物活化、血管生成、抗侵袭和转移，还具有调节细胞的存活率。目前已知南方红豆杉水提物通过抑制PI3K/AKT 信号通路的激活来抑制癌细胞的侵袭，但是，南方红豆杉的抗侵袭、转移的特性，是否与抑制上皮间质转化有关还得进一步确认。本实验通过体外研究，探讨南方红豆杉水提物对胃癌NCI-N87 细胞上皮间质转化（EMT）功能及相关机制，报道如下。

1.资料与方法

1.1 细胞与细胞培养

HER2 阳性人胃癌NCI-N87 细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，在浙江中医药大学实验中心培养。NCI-N87 细胞培养于5% CO2，37 ℃培养箱（湿度95%）条件下，培养于含10% FBS，青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/mL 的RPMI1640 培养基中。实验时取对数生长期细胞。本研究经浙江中医药大学实验中心伦理委员会批准（伦理审批号：KYLL-2020-127）。

1.2 药物

南方红豆杉，规格8 g/包，采购自宁波泰康红豆杉生物工程有限公司。将80 g 南方红豆杉放置于无菌容器中进行浸泡，过夜浸泡12 h，再使用8 倍清水将其煮沸30 min，倒出药液。将药液放入5 倍清水中，煮沸20 min，使用真空抽滤器对药液进行过滤，并将其中水分蒸发至100 mL，此后使用旋转蒸发仪，通过水浴法将药液浓缩至40 mL，再使用真空干燥箱对其进行干燥，得浸膏，其浓度计算后为10.65%。取用1 g 南方红豆杉膏状提取物放入10 mL 超纯水中，待其溶解后，使用高速冷冻离心机12 000 rpm 对其进行离心15 min 后取上清液，再通过0.22 μm 微孔滤膜进行除菌处理，最后制成母液浓度100 mg/mL，并置于-20 ℃的冰箱中备用。

1.3 试剂及仪器

转化生长因子β（TGF-β），贮藏在2 ～8 ℃冰箱中备用。抗体包括：E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白均购自美国Sigma Aldrich 公司。Transwell 试剂盒，采购于美国康宁，细胞侵袭浸润试剂盒购自Millipore。本研究所有仪器设备，均有由浙江中医药大学实验中心提供。

1.4 方法

（1）造模及分组NCI-N87 细胞培养到对数生长期1×105/孔接种于24 孔细胞培养板中，加入转化生长因子10 mg/L 诱导48 h。同时对照组选取小牛血清白蛋白子10 mg/L 诱导48 h，使用聚焦显微镜对其进行观察并拍照，用过观察发现转化生长因子诱导的细胞不再是多角形生长而是转化为长梭形间充质细胞形态，且细胞多分散为单个，出现迁徙突触。对照组细胞呈上皮细胞形态，形似鹅卵石，且细胞分布较为密集。采用奇偶分组法，将其分为5组，分别是空白对照组、TGF-β诱导组（10 mg/L）、TGF-β+（低、中、高剂量）红豆杉组，剂量分别为（400、800、1 600 μg/mL）。（2）细胞体外迁移、侵袭实验Transwell 小室、基质胶和移液枪头提前在4 ℃冰箱预冷30 min。使用无血清培养基对进行1:4 稀释，同时分别将稀释胶50 μL缓慢加入到24-well Transwell小室中，使其将上室底部均匀铺满，并放置于37 ℃培养箱中进行孵育5 h；再将上室中残余液体吸出，将50 μL 无血清培养基添加至每个小室中，温度37 ℃，时间30 min，再吸去培养基。将200 μL 细胞悬液加入Transwell 小室的上室每孔中，操作时要避免气泡出现，并控制细胞分布均匀；600 μL 含20%胎牛血清的细胞培养基加入至下室中，并一齐放入培养箱中进行孵育；等待细胞状态恢复且完全贴壁，再对其进行分组；与划痕实验相一致。将培养箱中Transwell 小室取出，去除培养液，使用PBS清洗3 遍；采用甲醇将膜下室细胞进行固定30 min，并风干小室；将600 μL 0.1%结晶紫染色液滴入24 孔板中，同时将小室放入其中，确保基底膜浸在染色液中，温度37 ℃，时间30 min；再使用PBS 清洗3 遍，用棉签将上室面的非侵袭细胞擦除干净，选取100 倍显微镜下的5 个不同的随机角度，对侵袭到膜下室面的细胞进行计数拍照，取5 个视野下的平均数值。（3）Western blotting 法检测EMT 相关蛋白表达，将NCI-N87 细胞以30 万/孔接种于6 孔板，用TGF-β 处理24 h，之后加入不同浓度南方红豆杉水提物处理24 h，弃细胞培养液，PBS 冲洗，将蛋白提取液样品作（聚丙烯酰胺凝胶）SDS-PAGE 电泳后转膜，封闭处理后放入一抗（鼠抗人，稀释度为1:1000）孵育2 ～3 h，洗涤缓冲液洗膜3 遍，10 min/遍左右；放入抗体稀释浓度为1:2 500 的二抗，洗涤缓冲液洗膜3 遍，10 min/遍左右，并浸入适量比例的化学发光试剂中（A 液与B 液比例为1:1）1 min，取出后在室温条件下进行干燥，同时使用用保鲜膜将其包置于暗盒中，压片曝光3 ～10 min，洗出成片，观察相应结果。（4）实时定量RT-PCR 将NCI-N87 细胞以30万/孔接种于6 孔板，用TGF-β 处理24 h，之后加入不同浓度南方红豆杉水提物处理24 h，弃细胞培养液，预冷的PBS 冲洗，每孔加入Trizol 试剂提取各组细胞总RNA，检测纯度，按试剂盒说明逆转录合成cDNA，同时内参照物选择管家基因β-actin mRNA，对mRNA 表达量进行定量分析；设计相关引物时需依照GeneBank 上的基因序列，聚合酶链式反应产物需要放置于琼脂糖凝胶进行电泳分离，对聚合酶链式反应产物进行分析时选用Bio-1D 凝胶分析软件。所有实验均重复至少3 次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（± s）表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 南方红豆杉水提物抑制TGF-β 诱导的NCI-N87细胞在体外划痕、迁移和侵袭实验

转化生长因子组24 h 后侵袭穿膜的细胞数较空白对照组具有显著提高；转换生长因子中加入南方红豆杉组24 h 后侵袭穿膜的细胞数有所减少，且中药剂量越高，细胞数越少；转化生长因子的诱导可使NCI-N87 细胞迁移和侵袭增强，而南方红豆杉能够抑制转化生长因子对细胞迁移和侵袭能力的诱导作用，呈一定的剂量依赖性。

2.2 南方红豆杉水提物抑制NCI-N87 细胞上皮间质转化

与对照组相比，转化生长因子处理后的细胞E-钙黏蛋白表达减少，而N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达增加；南方红豆杉能抑制TGF-β 诱导的NCI-N87 细胞EMT，引起E-钙黏蛋白的增加而N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达抑制。

2.3 南方红豆杉水提物通过PI3K/AKT 信号通路抑制TGF-β 诱导EMT

与对照组相比，TGF-β 组PI3K、Akt、p-Akt 的表达均增加；给药后各治疗组mRNA 表达与TGF-β 组相比均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量相关性；同空白对照组相比，TGF-β+低剂量红豆杉组高于空白对照组；TGF-β+中剂量红豆杉组高于空白对照组；统计学无显著差异；TGF-β+高剂量红豆杉组低于空白对照组差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 Real-time PCR 检测PI3K、AKT1、mTOR 基因表达（± s）

表1 Real-time PCR 检测PI3K、AKT1、mTOR 基因表达（± s）

组别 剂量 PI3K空白对照组 0 0.7018±0.0676 TGF-β 组 10 mg/L 0.9901±0.3977 TGF-β+低剂量红豆杉组 10 mg/L+400 μg/mL 0.9683±0.1323 TGF-β+中剂量红豆杉组 10 mg/L+800 μg/mL 0.7616±0.0112 TGF-β+高剂量红豆杉组 10 mg/L+1 600 μg/mL 0.5234±0.0386组别 AKT1 mTOR空白对照组 0.612±0.0753 0.5013±0.1182 TGF-β 组 1.2286±0.1675 1.0532±0.0158 TGF-β+低剂量红豆杉组 1.0858±0.1456 0.8172±0.0674 TGF-β+中剂量红豆杉组 0.8018±0.3867 0.6926±0.0678 TGF-β+高剂量红豆杉组 0.5656±0.1778 0.4162±0.0652

3.讨论

胃癌5 年生存率和预后差的主要原因是肿瘤能够浸润、侵袭和转移淋巴结、远端组织以及周围组织，大部分胃癌或胃食管结合部癌患者在诊断时已为进展期、转移晚期或不可手术阶段，预后较差。上皮间质转化（EMT），由上皮细胞脱黏附转变成有迁移能力的间质细胞，主要作用于胚胎发育、肿瘤转移等相关机理。据相关研究分析[3]，多种细胞外信号可使上皮间充质转化得到激发，包括细胞胶原、透明质酸，多种可溶性生长因子等，均能对EMT诱导信号通路产生激活作用。包括TGF信号通路、受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）通路以及Notch 通路等。转化生长因子属于EMT 诱导因子的一种，除对经典Smad 依赖的信号通路进行激活外，还能使多条EMT 非经典信号通路得到激活，包括Ras/MAPK、PI3K/AKT 等信号通路，进而促使上皮间充质转化发生[4]。肿瘤细胞生长因子EGF、VEGF 表达上调依赖于TGF-β诱导，其作为细胞外刺激信号通过激活PI3K/AKT 通路促进细胞增殖和转移[5]。实验表明，TGF-β 诱导胃癌NCI-N87 细胞后可激活PI3K/AKT 通路促进胃癌NCI-N87细胞EMT 和转移。本实验通过加入转化生长因子刺激NCI-N87 胃癌细胞诱导上皮间质转化，对南方红豆杉水体物抑制PI3K/AKT 信号通路调控以及逆转上皮间质转化的发生进行分析。

南方红豆杉性平、味甘、入肺、胃、大肠经，具有软坚散结的功效[5]。南方红豆杉在我国分布最为广泛，据相关研究表明，红豆杉中包含紫杉醇、紫杉黄酮、小分子类物质（鞣质）、红豆杉多糖、等40 多种有效成分[6]。红豆杉提取物的主要作用原理是对肿瘤细胞SMMC-7721和HEp-2 进行诱导，使其凋亡，从而对肿瘤细胞生长起到抑制作用；同时促进合成干扰素、肿瘤坏死因子以及白介素-2 等细胞因子；并使T 淋巴细胞、B 淋巴细胞以及肿瘤细胞得到激活，从而使抗体与补体免疫功能提高。南方红豆杉具有抑制人HER2 阳性胃癌NCI-N87 细胞生长的作用，能够使其繁殖受阻，进而死亡。南方红豆杉水提物能够抑制HER2 阳性裸鼠移植瘤生长，并将其杀死，同时还可以阻碍胃癌细胞成长，但是其对NCI-N87 胃癌细胞上皮间充质转化是否有逆转作用尚需进一步研究。

本文结果显示南方红豆杉能通过PI3K/AKT 信号通路抑制TGF-β 诱导的EMT，进而减弱NCI-N87 细胞侵袭迁移能力。本研究明确了南方红豆杉抑制人胃癌NCI-N87细胞侵袭转移作用与PI3K/AKT 信号通路有关，但是PI3K/AKT 信号通路家族成员众多，对此信号通路作用靶点仍需进一步的研究。