基于指纹图谱和网络药理学对经典名方竹茹汤中葛根的质量标志物（QMarker）预测分析

王 璐，张礼欣，贾奥蒙，毛春芹，李 林，侯金才，郭 勇，陆兔林*，申屠银洪

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

2.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430

3.浙江桐君堂中药饮片有限公司，浙江 桐庐 311500

竹茹汤（Zhuru Decoction，ZRD）出自宋朝许叔微的《普济本事方》卷第四·翻胃呕吐霍乱·竹茹汤，原方由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜、大枣6味药组成，主治胃热呕吐，其后经历药味组成、剂量和功效主治等方面的改变，还可用于治疗酒呕。方中重用葛根，清胃生津，是为君药；半夏、竹茹、生姜和胃止呕；甘草、大枣健脾益气，调和诸药[1-2]。

葛根Puerariae Lobatae Radix（PLR）来源于豆科葛属植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi的干燥根[3]，味甘、辛，凉，能解肌退热、生津止渴、解酒毒。用于外感发热头痛、口渴、酒毒伤中。据报道[4]，葛根水提物能缩短小鼠醉后睡眠时间，加速酒精在肝脏中代谢速度，降低肝损伤的风险，另有研究[5]证明葛根中黄酮和葛根素等成分可通过调节酒精和脂质代谢减轻斑马鱼酒精性肝损伤。葛根除胃热、解酒的作用与竹茹汤和胃止呕、治疗酒呕的功效相一致，此外，葛根被广泛应用于心脑血管疾病和免疫系统疾病的临床治疗[6]。

为提升中药及产品质量标准，对现有质量评价与控制方法及存在问题进行研究分析后，刘昌孝院士[7]于2016年提出了中药质量标志物（Q-Marker）的概念，后经张铁军等[8]总结归纳得出中药质量标志物应符合有效、特有、传递与溯源、可测和处方配伍的“五原则”，现如今预测中药Q-Marker多遵循此五原则。

中药及其复方制剂成分复杂，质量难以控制，Q-Marker的建立有利于中药全程质量控制及质量溯源，是中药质量评价与控制的指标。中药指纹图谱能充分反应中药化学成分的传递和溯源，网络药理学则是近几年兴起的基于成分-靶点-通路-疾病科学地对中药药效进行预测的一种手段，也能从理论上阐明中药的有效性，指纹图谱结合网络药理学适用于中药多成分、多靶点、多通路的特点。本课题组基于Q-Marker理论，通过指纹图谱和网络药理学的研究方法，以“Q-Marker五原则”为核心，预测经典名方竹茹汤中葛根的Q-Marker，以期为经典名方中单味药的Q-Marker研究提供借鉴，同时为全面控制经典名方竹茹汤奠定基础，为进一步研制竹茹汤相关制剂及其质量控制提供思路[9-12]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，DAD紫外检测器，Chem Station色谱工作站，安捷伦科技有限公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FA1104N电子天平，d＝0.1 mg，上海菁海仪器有限公司；MS-105D电子天平，d＝0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集团；H1650-W台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ZYX0071超纯水系统，南京汉隆实验器材有限公司；MGH21S011红外炉，广东美的生活电器制造有限公司。

1.2 试药

对照品葛根素，批号110752-201615，质量分数95.4%，购自中国食品药品检定研究院；对照品3′-羟基葛根素（批号180102，质量分数≥98%）、3′-甲氧基葛根素（批号171204，质量分数≥98%）、葛根素芹菜糖苷（批号171216，质量分数≥98%）均购自南京森贝伽生物科技有限公司；对照品大豆苷（批号20111016，质量分数≥98%）、大豆苷元（批号YY20101110，质量分数≥98%）均购自上海源叶生物技术有限公司。甲醇，分析纯，山东禹王实业有限公司化工分公司；乙腈，色谱纯，默克股份两合公司；甲酸，色谱纯，美国恩科公司；水为娃哈哈纯净水。

竹茹汤由葛根、甘草、半夏、竹茹、生姜和大枣6味药组成，均购自道地产区或主产区，经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定。每味药共收集多个产地，总批次不少于15批，均明确了各药材基原、药用部位、产地及其采收加工方法。本课题组前期已按照《中国药典》2020年版项下各味药的检测方法和要求对药材进行检测，合格的优质药材按照《中国药典》2020年版项下炮制方法及经典名方申报资料要求拟定的饮片草案，将药材炮制成合格饮片。

本实验共研究15批葛根药材水煎液、15批葛根饮片水煎液以及15批不同批次饮片及3批同批次饮片制备的共18批竹茹汤，其中葛根来自陕西、安徽、河南3个产地共15批，为豆科葛属植物野葛P.lobata(Willd.) Ohwi的干燥根；半夏来自江苏泰州、甘肃天水、贵州3个产地共15批，为天南星科半夏属植物半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.的干燥块茎；甘草来自新疆阿勒泰、内蒙鄂尔多斯、甘肃陇西3个产地共15批，为豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎；竹茹来自江西、四川2个产地共15批，为禾本科刚竹属植物淡竹Phyllostachys nigra(Lodd.) Munro var.henonis(Mitf.) Stapf ex Rendle的茎秆的干燥中间层；生姜来自山东、云南2个产地共15批，为姜科姜属植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎；大枣来自山东新泰、河北沧州、山西闻喜3个产地共15批，为鼠李科枣属植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实。药材及对应饮片来源与批号见表1。

表1 药材及对应饮片来源与批号Table 1 Source and batch number of medicinal materials and decoction pieces

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil 100-5 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0～4 min，0.5%～8%乙腈；4～25 min，8%～10%乙腈；25～36 min，10%乙腈；36～38 min，10%～14%乙腈；38～55 min，14%～16%乙腈；55～60 min，16%～23%乙腈；60～70 min，23%～30%乙腈；70～85 min，30%～75%乙腈；85～89 min，75%～100%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长280 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取各对照品适量，加50%甲醇配制成含3′-羟基葛根素88.11 μg/mL、葛根素285.14 μg/mL、3′-甲氧基葛根素92.57 μg/mL、葛根芹菜糖苷114.97 μg/mL、大豆苷86.74 μg/mL、大豆苷元57.49 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

本课题组前期已对竹茹汤基准样品的制备方法、工艺参数进行了考察，按照经典名方申报资料要求随机组合多批次，采用确定的煎煮方法得到15批葛根药材水煎液（编号YC1～YC15）、15批葛根饮片水煎液（编号YP1～YP15）和18批竹茹汤（编号ZRD1～ZRD18）和1批缺葛根阴性水煎液（编号YX）。分别取上述液体30 mL于蒸发皿水浴挥干，50%甲醇复溶，定容至10 mL量瓶中，离心，过0.22 μm微孔滤膜即得。

2.4 葛根药材、饮片水煎液及竹茹汤指纹图谱研究

2.4.1 精密度试验 取ZRD供试品溶液，重复进样6次，记录指纹色谱图。选择保留时间稳定、面积大的葛根素色谱峰作为参照峰，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.13%，相对峰面积RSD值均小于4.42%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取平行制备的ZRD供试品溶液6份，在上述色谱条件下进样，记录指纹色谱图。以葛根素为参照峰，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.12%，相对峰面积RSD值均小于4.97%，表明该方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取ZRD供试品溶液，分别室温放置0、2、4、8、12、24 h后，在上述色谱条件下进样，记录指纹色谱图。以葛根素为参照峰，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.12%，相对峰面积RSD值均小于4.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 指纹图谱的建立 将15批葛根药材水煎液、15批葛根饮片水煎液及18批竹茹汤基准样品供试品溶液分别进样测定，将图谱以AIA格式保存，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）。以S1图谱作为参照谱，采用中位数法，进行多点校正和色谱峰匹配，15批葛根药材水煎液、葛根饮片水煎液均分别得到了21个共有峰，18批竹茹汤基准样品得到了25个共有峰，15批葛根药材水煎液、葛根饮片水煎液以及18批竹茹汤基准样品的指纹图谱叠加图分别见图1～3。

图1 15批葛根药材水煎液指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR decoction

2.4.5 相似度分析 将15批葛根药材、饮片水煎液和18批竹茹汤的指纹图谱均导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012年版），计算相似度，结果15批葛根药材水煎液（编号YC1～YC15）的相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；15批葛根饮片水煎液（编号YP1～YP15）的相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000；18批竹茹汤（编号ZRD1～ZRD18）的相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、1.000、1.000、1.000、0.999、0.999；可见，15批葛根药材、15批葛根饮片水煎液和18批竹茹汤的指纹图谱相似度均＞0.95，表明葛根药材、饮片水煎液和竹茹汤的质量稳定均一。

图2 15批葛根饮片水煎液指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprints of 15 batches of PLR pieces decoction

图3 18批竹茹汤指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of 18 batches of ZRD

2.4.6 共有峰的指认及相关分析 根据指纹图谱分析结果，将多批次葛根药材水煎液、葛根饮片水煎液、竹茹汤指纹图谱共有模式、缺葛根阴性水煎液和混合对照品的指纹图谱进行叠加。采用对照品比对的方式，指认了葛根药材、饮片水煎液及竹茹汤指纹图谱共有模式中的6个共有峰，分别为3′-羟基葛根素（4号峰）、葛根素（6号峰）、3′-甲氧基葛根素（7号峰）、葛根芹菜糖苷（9号峰）、大豆苷（11号峰）、大豆苷元（23号峰），且这6个峰在竹茹汤中无阴性干扰，见图4。

图4 竹茹汤、葛根药材、葛根饮片水煎液指纹图谱共有模式图和混合对照品、缺葛根阴性水煎液色谱图Fig.4 Fingerprints of ZRD, PLR decoction, PLR pieces decoction and chromatograms of mixed control substance and negative decoction of PLR pieces

对15批葛根药材水煎液、饮片水煎液指纹图谱相似度计算，各产地葛根指纹图谱相似度均大于0.95，说明不同产地间葛根药材及饮片的整体化学组分类似，且与复方共有6个特征性成分，由此看出葛根中这6个成分实现了“药材-饮片-复方”的传递，具有良好的传递与溯源性，且在配伍处方中也能得到较好的指认，以此为基础将筛选出的竹茹汤中葛根的6个活性成分进一步进行网络药理学研究，选取的这6个成分均在指纹图谱中响应值前10，且根据前期文献研究推测可能与竹茹汤治疗胃热呕吐、解酒呕的功效关联性更为密切。

2.5 基于成分-靶点-通路的网络药理学分析

2.5.1 候选化合物靶点预测 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），获取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6个化合物的靶点信息；通过PubChem Compound数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）进行搜索，将得到的化合物SMILES结构输入Swiss Target Prediction服务器（http://new.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，并结合TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）数据库，得到上述6个化合物的作用靶点，筛去重复靶点，最终得到与其有关的作用靶点共159个。

2.5.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）网络构建 PPI能够体现蛋白靶点彼此之间的相互作用，这些作用包括参与传递生物信号、调节基因表达、调控能量和物质代谢及细胞周期等。对6个化合物的靶点相互作用进行分析筛选，能够辨识与竹茹汤功效关联更加密切的成分，进一步确证复方中葛根的Q-Marker。将筛选出的159个靶点，导入在线STRING 11.0数据库软件（https://string-db.org/cgi/input.pl）进行PPI网络分析，选择物种为“Homo sapiens”，蛋白交互参数评分值为“high confidence＞0.9”，隐藏网络中无联系的节点，其余参数设置不变，获得核心靶点PPI网络图（图5），结果共获得159个节点，421条边。将PPI结果以TSV文本格式导入Cytoscape 3.7.1软件中，并利用Cytoscape 3.7.1软件中的“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑属性分析，计算选取度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3个重要拓扑参数均大于中位数且度值≥15的靶点作为核心靶点。经筛选得到14个核心靶点，结果见表2。经分析发现，这14个靶点9个与大豆苷元相关、7个与葛根素相关、3个与大豆苷相关。

表2 核心靶点网络的拓扑学性质Table 2 Topological properties of core targets network

图5 作用靶点PPI网络图Fig.5 PPI network diagram of targets

2.5.3 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 利用David 6.8数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对14个潜在的核心靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析主要包括基因产物细胞功能、分子功能和生物功能分析，对基因进行注释和分类；KEGG通路富集分析可以得到竹茹汤中葛根核心靶点的信号通路。GO和KEGG分析均选取P＜0.05，具有统计学意义。

GO富集分析共获取78个条目，其中生物过程（biological process，BP）占54个，分子功能（molecular function，MF）占20个，细胞组成（cellular component，CC）占4个，设置P＜0.05，错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05，选取显著性程度前20的条目进行展示，结果见图6。结果显示，以上靶点参与的生物过程包括RNA聚合酶II启动子转录的正负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、平滑肌细胞增殖的正调控、转录正调控、核染色质、相同蛋白质结合、酶结合、转录因子结合、染色质结合等分子功能，推测竹茹汤中葛根通过这些功能调控机体，解热止呕。

图6 GO富集分析 (前20条)Fig.6 GO analysis of number of genes (top 20)

KEGG富集分析共得到75条通路，根据显著性程度P＜0.01，筛选得到43条相关通路，其中排名前20的通路如图7所示，主要包括乙型肝炎、癌症通路、HIF-1信号通路、炎症性肠病、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）信号通路等。

图7 KEGG富集分析Fig.7 Enrichment analysis results of KEGG

2.5.4 成分-靶点-通路网络构建 根据筛选得到的6个成分、159个靶点和20条关键通路，运用Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点-通路网络图，结果见图8。根据Cytoscape 3.7.1软件对网络图进行分析，以成分、靶点、信号通路的度值为参考，发现大豆苷元、葛根素、大豆苷的连接度相对较高，可能是竹茹汤中葛根发挥治疗胃热呕吐、酒呕功效的活性物质；转录因子p65（transcription factor p65，RELA）、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-α serine/threonine-protein kinase，AKT1）、TNF、信号转导和转录激活因子1-α/β（signal transducer and activator of transcription 1-α/β，STAT1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、STAT3、转录因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、细胞肿瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53，TP53）9个靶点的连接度较高（度值≥10），可能是竹茹汤中葛根发挥作用的关键靶点；20条信号通路中除Pathways in cancer（度值＝11）、Hepatitis B（度值＝9）略高，NOD-like receptor signaling pathway（度值＝5）略低外，其余差异不大，因此，20条信号通路均可能是竹茹汤中葛根的关键信号通路。

图8 “成分-靶点-通路”网络图Fig.8 “Compound-target-pathway” network diagram

2.6 整合分析

本研究通过建立葛根药材、饮片水煎液和竹茹汤的指纹图谱，指认其共有峰，并对指认出的成分进行网络药理学分析，筛选得到竹茹汤中葛根的核心靶点和信号通路，运用Cytoscape 3.7.1软件构建成分-靶点-通路网络图，根据度值分析得出结论：大豆苷元、葛根素、大豆苷3个成分可能是竹茹汤中葛根发挥治疗胃热呕吐、酒呕功效的活性成分。朱卫丰等[13]基于Q-Marker的新概念从成分特有性、传统功效、传统药性、成分可测性、中药配伍环境（药对配伍、复方配伍、经典方配伍）、成分有效性等多个方面对单味药葛根的Q-Marker进行了深入全面的探讨分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷在传统功效、成分可测性、成分有效性这3个方面均有显著的Q-Marker特性。基于Q-Marker的五原则进行分析，这3个成分在竹茹汤中从药材-饮片-复方均能实现良好的传递与溯源，且在复方中无阴性干扰，为葛根所特有，网络药理学从理论上证明了其有效性，综上结合指纹图谱和网络药理学对竹茹汤中葛根的Q-Marker进行预测分析，大豆苷元、葛根素、大豆苷这3个成分基本符合Q-Marker五原则，故预测其为竹茹汤中葛根潜在的Q-Marker。

3 讨论

本研究依据刘昌孝院士[7]提出的Q-Marker理念，采用指纹图谱和网络药理学相结合的方法分析预测竹茹汤中葛根发挥治疗胃热呕吐功效的QMarker。通过建立葛根药材、饮片水煎液和竹茹汤的指纹图谱从传递和溯源性、可测性的角度对葛根进行分析，指认出3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6个成分，从Q-Marker特有性的角度进行分析，这6个成分均是竹茹汤中葛根的特有成分，方中无其他药味干扰。

运用网络药理学从有效性的角度对其进行分析，发现大豆苷元、葛根素、大豆苷3个活性成分通过调控RELA、AKT1、TNF、STAT1、IL-6、MAPK14、STAT3、JUN、TP53、组蛋白乙酰转移酶p300（histone acetyltransferase p300，EP300）、表皮生长因子受体 erbB1（epidermal growth factor receptor erbB1，EGFR）等关键靶点，作用于Interleukin-6、TNF信号通路、NOD样受体（NODlike receptor）信号通路、Toll样受体（Toll-like receptor）信号通路等关键信号通路发挥竹茹汤治疗胃热呕吐、酒呕的功效。

葛根主要含有异黄酮类、三萜类、皂苷类和多糖类，含量最多的成分为异黄酮类物质，主要包括大豆苷、大豆苷元与葛根素等，其中葛根素含量占比最大[14]。葛根素能够显著改善高脂诱导的糖尿病小鼠抑郁症状、对心血管、脑部、肝脏损伤均具有保护作用[15]，大豆苷作为中药中天然的抗酒精成瘾剂，有研究以此为线索改进了编码线粒体醛脱氢酶（ALDH2）的设计，而ALDH2非活性变异形式的ALDH2*2基因几乎保护了该基因的所有载体免受酒精中毒的侵害[16]。大豆苷元是一种从植物中提取的次生代谢物，具有类黄酮结构，以其对胃肠道疾病的保护作用而闻名，研究表明大豆苷元对动物模型中食管反流引起的食道黏膜损伤具有预防作用[17]。

14个核心靶点中EGFR是一种跨膜糖蛋白，属蛋白激酶家族的成员，具有诱导受体二聚和酪氨酸自磷酸化并导致细胞增殖。这个基因的突变与原发性乳腺癌发生、生长及转移有关[18]，有文献报道EGFR可能在葛根解热功效中发挥重要作用[19]。IL-6是一种有效的急性反应诱导剂，在感染和组织损伤期间，IL-6的快速生成有助于宿主防御，TNF主要由巨噬细胞分泌，是引起发热的有效热原，在一定条件下可刺激细胞增殖和诱导细胞分化，最新研究发现，IL-6与TNF在众多中药抗酒精性胃损伤机制中起到关键作用[20]。

由此可推测，竹茹汤中葛根的活性成分可能通过作用于这些蛋白靶点起到治疗胃热呕吐、酒呕的疗效。葛根可能通过调控HIF-1信号等7条代谢通路起到解热的作用[19]。高思佳等[21]研究发现IL-6、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路等10条通路参与葛根解肌退热，部分通路与炎症反应相关，因此推测竹茹汤中葛根治疗胃热呕吐的机制，可能是通过相关靶点作用于这些信号通路。

综上所述，初步预测大豆苷元、葛根素、大豆苷为竹茹汤中葛根潜在的Q-Marker。竹茹汤具有多成分、多靶点、多途径协同作用的特点，本研究采用现代网络药理学方法，预测竹茹汤中君药葛根与复方功能主治密切相关的关键靶点及信号通路，为进一步实验验证、潜在药理学机制及临床拓展应用提供参考依据。本研究基于中药化学与中药药理学，整合多学科技术方法，基于可测性、可追溯性、有效性开展竹茹汤中葛根Q-Marker的系统辨识与确认，为后期深入研究葛根及其相关复方的作用机制提供参考，有助于建立全程质量控制体系，提高中药产业质量控制水平[22]。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突