槐花散白头翁汤合用对急性放射性直肠炎大鼠的治疗作用及其机制研究*

赵 杨， 张玉双， 王玉祥， 张 明， 史会娟， 李 晶△

(1. 河北医科大学中西医结合学院， 2. 河北医科大学第四医院中医科， 3. 河北省人民医院， 石家庄 050017)

放射性直肠炎( radiation proctitis, RP)是盆腔恶性肿瘤患者放射线治疗后的主要并发症，其发病率在逐年增加，可高达20%。急性放射性直肠炎(acute radiation proctitis, ARP)的临床表现包括腹痛、腹泻、黏液便、里急后重等症状，严重可出现血便和肠梗阻，影响患者的生活质量。目前西医常见的治疗有硫糖铝、美沙拉嗪、皮质类固醇、高压氧舱等，虽有一定疗效但不良反应较多，且复发率高。中医认为此病多属“肠癖”、“痢疾”、“腹痛”、“泄泻”等范畴，放射线被认为外来“火、热、毒”邪，病机总属热毒内侵，火热毒邪损伤肠络，故治疗上以清热凉血散瘀为基本原则[1]。槐花散合白头翁汤是治疗痢疾的经典方剂，针对临床患者能够有效缓解患者症状。本研究观察了槐花散合白头翁汤对ARP大鼠的的疗效以及对NF-κB、ICAM-1、VCAM-1的影响，为ARP的中医学防治提供进一步的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养环境

实验动物为SPF级SD雌性大鼠40只，体质量为160～180 g，由北京斯贝福生物技术有限公司提供。实验动物饲养于温度20℃～28℃，相对湿度在50%～60%之间，12 h明/暗循环环境下，饲喂标准水和动物饲料，适应性饲养1周。

1.2 实验药物及制备

槐花散合白头翁汤：白头翁10 g槐花散12 g 荆芥穗10 g 侧柏叶10 g 枳壳10 g 秦皮10 g 黄连5 g 黄芩5 g(以上中药均为颗粒剂，1副中药颗粒剂为8.6 g，相当于1副中药72 g药量，辅料主要成分是乳糖、淀粉等)，美沙拉嗪肠溶片，以上药物均购自神威药业集团有限公司，粉碎后合成散剂放置于4℃冰箱密封保存。

1.3 实验仪器及主要试剂

Elekta Synergy医用直线加速器(医科达医疗器械有限公司 中国上海)；D3024R台式高速冷冻型微量离心机(美国Scilogex公司)；Nanopure超纯水仪(Thermo Fisher Scientific公司)电泳仪(Bio-Red公司 美国加利福尼亚州)；EVOS FL Auto 2全自动活细胞成像系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)；水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司 中国上海)；核因子-κB(NF-κB)的抗体、ICAM-1、VCAM-1 ELISA试剂盒均来自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 实验动物分组及给药方法

将40只SD大鼠随机分为4组，Control组、Model组、Mesalazine组(阳性对照组)和Formular组，每组10只。除Control组外，其余各组大鼠造模成功后开始灌胃治疗，1 次/d，连续 14 d。按成人临床等效剂量(体表面积法折算)[2]， Control组、Model组均给予生理盐水灌胃每天10 ml/kg，Mesalazine组和Formular组药物分别用去离子水稀释为美沙拉嗪溶液和中药汤剂，Mesalazine组给予美沙拉嗪溶液 0.27 g/kg 灌胃，Formular组分别给予(0.91 g/kg) 灌胃，四组大鼠灌胃所有大鼠灌胃体积为每天10 ml/kg，连续14 d。

1.5 造模

除Control组不予照射外，其余各组大鼠均接受6MV-X线照射。各照射组大鼠于照射前8 h禁食，各组大鼠使用水合氯醛进行麻醉，待大鼠肌肉完全松弛后，以仰卧体位将其固定在特制照射板上，以 6MV-X线直线加速器单次大剂量照射，照射范围自耻骨联合至肛门，照射野面积3 cm×4 cm，源皮距80 cm, 照射剂量为20 Gy[3]。 照射完毕后，送返实验动物中心继续饲养。观察大鼠情况，照射后出现腹泻、黏液脓血便症状和直肠病理改变则造模成功。

1.6 一般情况观察

照射后连续观察14 d，每天称取大鼠重量，比较四组大鼠一般征象评分，包括饮食摄水量、排便情况、体重、活动度、反应速度、毛发光泽、有无消瘦、便血、死亡等情况。

1.7 判定标准

自拟大鼠一般征象评分标准：1分，大便成形，肛周皮毛无损，饮食、饮水无明显变化，体质量无减轻，活动自如，皮毛光洁；2分，大便不成形，黏液便，肛周皮肤脱毛潮红，直径<0.5 cm，饮食、饮水稍减少，体质量减轻1～2 g，喜静，皮毛光洁度差；3分，腹泻、黏液、血便、肛周皮肤脱毛潮红，直径0.5～1 cm，饮食、饮水明显减少，体质量减轻2～3 g，蜷缩少动现象，皮毛欠光洁；4分，腹泻、水样便和/或肛门出血，肛周皮肤脱毛潮红，直径>1.0 cm，拒食、拒水，体质量减轻>3 g，蜷缩少动，有弓背扭体现象，皮毛不光洁。

1.8 直肠病理组织学观察

取2 cm直肠组织，10%多聚甲醛固定后，清洗、包埋、切片后HE染色，显微镜下观察直肠组织病理形态变化。

1.9 生化指标检测

取冻存直肠组织，研磨匀浆，放入低温离心机离心，取上清液，BCA蛋白定量后，采用Western blot法检测直肠组织中NF-κB蛋白表达，采用ELISA法检测血清中ICAM-1、VCAM-1含量。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况

各照射组经照射后，前2日无明显变化，于第三天开始出现不同程度摄食量、饮水量的减少，反应迟缓、毛色不洁、蜷缩少动，有不同程度的稀便、黏液便出现，大便次数增多。第5日开始个别严重者出现柏油样便和脓血便现象。与Contol组比较，Model组评分显著升高(P<0.01)，Mesalazine组和Formula组评分高于Contol组。Mesalazine组和Formula组一般征象评分低于Model组(P<0.01)，Formula组评分低于Mesalazine组(P>0.05，表1)。

Tab. 1 The general signs of each group were scored at different n=10)

2.2 槐花散合白头翁汤对大鼠体重的影响

记录各组大鼠自给药第1日开始到给药后第14日每天平均体重变化。给药后1～4 d各组大鼠体重无明显差异；第5日开始用药组体重增长变快，Control组日平均体重高于其他各组，Model组日平均体重最低(P<0.05)；照射后第7日，Mesalazine组和Formula组体重稍有增加，Model组与Control组比较体重下降明显(P<0.01) ，其余各组差异无统计学意义(P>0.05) ；至第14日，Model组明显低于Control组(P<0.01)，Formula组与Mesalazine组体重均高于Model组(P<0.01)，与Control组比较体重相差较小。Formula组与Mesalazine组比较，体重相近，差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

Tab. 2 The average daily weight of rats in each group(g, n=10)

2.3 槐花散合白头翁汤对大鼠直肠组织病理形态学的影响

光学显微镜下观察可见，Control组直肠黏膜形态结构较好，直肠隐窝无扩张、畸形，直肠组织黏膜无溃烂、出血和炎性细胞浸润；与Control组比较，Model组上皮细胞稀疏，部分脱落、糜烂、坏死，绒毛高度降低，黏膜及黏膜下出现明显的空泡样变性，间质纤维增多，大量炎症细胞浸润，结合上述大鼠ARP症状则表明造模成功；Mesalazine组与Model组比较，直肠上皮细胞完整性较好，腺体结构改变较轻；Formular组与Model组比较，病变明显减轻，直肠黏膜形态结构较好，无明显溃烂、出血和炎性细胞浸润(图1)。

Fig. 1 Pathological changes of rats in each group(Original magnification × 200)

2.4 槐花散合白头翁汤对大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1含量的影响

与Control组比较，Model组大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1含量显著增加，具有统计学差异(P< 0.01)，Mesalazine组和Formula组ICAM-1、VCAM-1含量增加较少。与Model组比较Mesalazine组和Formula组大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1水平显著低于Model组，具有统计学差异(P<0.01)与Mesalazine组比较Formula组大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1水平略低于Mesalazine组，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

Tab. 3 Effects of huaihua powder and baitouweng formula decoction on the contents of ICAM-1 and VCAM-1 in serum of rats(ng/ml， n=10)

2.5 槐花散合白头翁汤对结肠病理组织中NF-κB蛋白表达的影响

与Control组比较，Model组NF-κB蛋白表达显著增多(P<0.01)，Mesalazine组和Fomular组NF-κB蛋白表达相近(P>0.05)。与Model组比较，Mesalazine组和Fomular组NF-κB蛋白表达均低于Model组(P<0.05)。与Mesalazine组比较，Formula组NF-κB蛋白表达略低于Mesalazine组，差异无统计学意义(P>0.05，图2，表3)。

Fig. 2 Effect of paitouweng decoction on the expression of NF-κB protein in the rectum of ARP rats

3 讨论

目前针对急性放射性直肠炎(acute radiation enteritis，ARP)的发展及作用机制，尚未完全明确，临床治疗方法比较单一，治疗效果一般，且存在较高复发率。美莎拉嗪为临床上常见的治疗ARP的药物。中医认为此病多属“肠癖”、“痢疾”、“腹痛”、“泄泻”等范畴，放射线是放射性直肠炎的特殊因素，中医认为其为外来“火、热、毒”邪[1]。放射性直肠炎病机总属正气亏虚、热毒内侵，故脾气虚弱，水湿不化，湿热下迫大肠，导致大便次数增多，火热毒邪损伤肠络，导致便下黏液脓血甚至便血，故治疗上以清热凉血散瘀为基本原则。我们前期临床研究表明，槐花散合白头翁汤治疗ARP患者，能够有效缩短症状缓解时间，减轻患者临床症状，尤其在大便次数、腹痛、里急后重、黏液便、便血等方面效果明显[4]。

槐花散中槐花苦微寒，善清大肠湿热，凉血止血，为君药。侧柏叶清热止血，可增强君药凉血止血之力，为臣药。荆芥穗炒用入血分而止血，枳壳行气宽肠，，共为佐药，以达“气调则血调”之目的。白头翁汤中以白头翁为君，清热解毒，凉血止痢。臣以黄连之苦寒，清热解毒；黄芩清热燥湿，共奏燥湿止痢之效。秦皮苦寒性涩，收敛作用强，四药并用，为热毒血痢之良方。槐花散合白头翁汤诸药合用，行气与止血相得益彰，践行了“行血则便脓自愈，调气则后重自除”的治疗方法。现代研究表明槐花可治疗痔疮和肠道出血，具有抗炎、抗出血、抗氧化、抗肿瘤的作用[5]，白头翁主要成分Anemoside B4具有抗炎和免疫调节的特性[6]，侧柏叶具有抗菌、抗肿瘤、凝血、抗炎的功效[7]，黄连具有抗炎抗氧化保护肠粘膜的作用[8-9]。

ARP的常见症状为大便次数增多、腹痛、腹泻、里急后重、黏液脓血便等。早期研究表明，肠损伤在放疗开始后的几天内就变得明显，并且主要是由于迅速扩散的隐窝上皮细胞死亡和固有层长时间的急性炎症反应所致，隐窝细胞死亡会导致绒毛上皮的置换不足，黏膜屏障破坏和黏膜炎症[10]。本次实验显示，与Model组相比Formular组能够明显减轻ARP大鼠大便次数、腹泻、黏液脓血便、体重等症状(P<0.01)，与Mesalazine组比较Formular组腹泻次数，腹泻，便血情况较好。病理结果显示Formular组较Model组直肠黏膜形态、上皮细胞完整性和腺体结构改变较轻(P<0.05)。以上提示，槐花散合白头翁汤通过改善ARP大鼠直肠组织黏膜损害进而改善ARP大鼠腹泻、黏液脓血便等症状。

辐射可导致多种微血管病理学改变，微血管损伤在放射性直肠炎中扮演着极其重要的角色[11]。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族成员，分布在内皮细胞、单核细胞等表面，是血管炎症期间由内皮分泌的关键分子[12]。通常在正常情况下，ICAM-1和VCAM-1不表达或很少表达，当炎症发生时，在炎症因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等刺激下表达迅速上升，增强了单核细胞与内皮细胞之间的黏附，促进炎症的发生和发展[13-14]。本实验结果显示Formular组血清中ICAM-1、VCAM-1的含量显著低于Model组(P<0.01)，以上提示槐花散合白头翁汤能够降低大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1的含量，从而改善微血管循环障碍，降低微血管损伤，进而抑制炎症的发展。

在ARP发病过程中，NF-κB通路的激活是最关键的环节，其中p65蛋白是NF-κB通路启动的关键蛋白，当炎症发生并启动NF-κB通路时，p65蛋白与NF-κB因子分离，在组织中的表达增多，其激活后可促进促炎细胞因子、趋化因子及黏附分子等的释放[15-16]。在急性期，由于紧密连接的表达减少和上皮细胞死亡引起的粘膜破坏导致炎症[17]。受损的血管内皮刺激细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌以及粘附分子的表达[18]。大剂量放射线照射后，直肠发生炎症反应，激活NF-κB信号通路[19-20]。ICAM-1、VCAM-1基因的启动子区域具有NF-κB的作用结合位点，活化的NF-κB可诱导血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1的基因表达，进而参与炎症反应[21]。本实验结果显示Model组直肠组织中NF-κB蛋白表达明显高于Formular组(P<0.01)，Mesalazine组和Formular组NF-κB蛋白表达低于Model组，以上结果表明，槐花散合白头翁汤能够下调ARP大鼠直肠组织NF-κB蛋白表达，降低大鼠血清中ICAM-1、VCAM-1的含量，改善直肠粘膜和微血管循损伤，从而减轻病变，美莎拉嗪为临床上常见的治疗ARP的药物，且具有一定治疗效果，本研究中美莎拉嗪与槐花散合白头翁汤治疗效果相近，甚至后者在改善直肠炎症状方面效果更好。

综上所述，本研究通过直线加速器照射建立ARP模型，探讨了槐花散合白头翁汤在改善ARP大鼠症状、调节ARP大鼠NF-κB、ICAM-1、VCAM-1方面的作用。研究结果可见，槐花散合白头翁汤能够改善放射线对肠道粘膜造成的病理损伤，通过降低NF-κB、ICAM-1、VCAM-1，来抑制炎症反应，减轻放射线导致的微血管和肠道黏膜病变，其具体的作用机制仍需进一步研究。