黄芪汤对延缓12C6+离子辐射致大鼠肾组织细胞凋亡的影响及相关机制*

安方玉， 颜春鲁， 刘永琦， 王彩霞， 苏 韫， 石 彪，杨双红， 郭 丹， 蒋国凤

(1. 甘肃中医药大学教学实验实训中心， 兰州 730000； 2. 甘肃中医药大学中医临床学院， 兰州 730000； 3. 甘肃中医药大学基础医学院，兰州 730000； 4. 甘肃中医药大学临床医学院， 兰州 730000； 5. 甘肃中医药大学药学院， 兰州 730000； 6. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究重点实验室， 兰州 730000； 7. 敦煌医学与转化教育部重点实验室， 兰州 730000)

重离子是不同于X-射线和γ-射线的重离子具有高传能线密度和形成特征性布喇格峰的一种射线，其能量释放是随深度的不同呈现出指数增加或减小的特点[1]，近年来被广泛应用于肿瘤患者的治疗。但是近年来也发现，重离子抗癌的同时，也会对机体正常组织诱发辐射损伤，严重影响着肿瘤患者的生存质量。据报道，辐射在造成中枢神经系统损伤的同时，能影响其调控的外周靶器官，使外周靶器官产生旁效应[2-3]。因此，寻找安全、低毒、高效的辐射防护剂显得尤为迫切。中医将辐射归属于“毒邪”范畴[4]，并认为气血两虚及血瘀是重离子辐射的基本病机。选自《医学心悟》中的经方黄芪汤具有益气滋阴，生津养血之功效，可能起到防护辐射损伤的作用。为了进一步探讨黄芪汤防辐射的分子机制，本实验通过对Wistar大鼠脑组织给予4Gy12C6+离子束单次照射复制重离子辐射脑损伤动物模型，观察黄芪汤对12C6+离子辐射脑损伤模型大鼠Bcl-2/NF-κB信号通路的干预作用，初步探讨黄芪汤对12C6+离子辐射脑损伤模型大鼠旁效应脏器肾组织细胞凋亡的调节机制，为辐射损伤的临床辅助用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取体质量为(180±20)g的50只雌雄各半的SPF级Wistar大鼠，购自甘肃中医药大学科研中心，实验动物质量合格证号为SCXK(甘)2015-0002，所有动物自由饮水、摄食1周。本实验经甘肃中医药大学科研中心实验动物伦理委员会的严格审查。

1.2 实验药物与主要试剂

黄芪汤方中的黄芪、熟地、麦冬、人参、枸杞子和五味子均购自甘肃中医药大学附属医院。反转录试剂盒和实时荧光定量PCR扩增试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，批号分别为：H7806580 和H7825375)；引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3(TaKaRa 宝生物工程(大连) 有限公司设计并合成)；引物β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3序列见表1。；大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司，批号为：1812R)；兔抗大鼠Bcl-2 抗体(美国 Gene Tex公司，批号：42970)；兔抗大鼠Bax 抗体(美国 Gene Tex公司，批号：39988)；兔抗大鼠Caspase-3 抗体(美国 Gene Tex公司，批号：42753)；GAPDH抗体(美国 Gene Tex公司，批号：41323)；兔抗大鼠NF-κB 抗体(Immuno Way公司，批号：B1101)。

Tab. 1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 主要仪器

MultiskanSky型全波长酶标仪(北京昊诺斯科技有限公司)；美国 Q5000 超微量紫外可见分光光度计(上海在途生物科技有限公司)；PCR热循环仪(上海旦鼎国际贸易有限公司)； 7500型实施荧光定量PCR扩增仪(上海兴曼生物科技有限公司)；Western blot分析仪(BIO-RAD)；BX53型光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4 实验药物给药剂量

黄芪汤方中的所有中药原药材均由本校甘肃省高校中藏药化学与质量研究室进行质量鉴定。黄芪汤由30 g黄芪、15 g熟地黄、15 g麦冬、15 g人参、15 g枸杞子和10 g五味子组成，人的临床用量为：100 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法：100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d)，作为中剂量。则黄芪汤高、中、低剂量分别为18、9、4.5 g/(kg·d)。

1.5 动物分组、给药及造模

SPF级Wistar大鼠自由饮水、摄食1周后，随机数字表法分为正常对照组，单纯辐射模型组，黄芪汤高、中、低剂量组，每组10只。正常对照组和单纯辐射模型组给予等体积生理盐水灌胃(10 ml/(kg·d))，黄芪汤高、中、低剂量组给予黄芪汤灌胃(剂量为18、9、4.5 g/(kg·d))，连续14日。第8日腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉各组大鼠，除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠脑组织均给予4Gy12C6+离子束单次照射[5]。重离子照射是在中国科学院近代物理研究所完成的，照射过程中的束流为12C6+离子束，照射过程中的能量、线性能量传递(LET)、吸收剂量和照射剂量等设置根据参考文献[5]实施。辐射后第7日称量各组大鼠的体质量后，股动脉采血处死各组大鼠，分离血清，摘取肾组织备用。

1.6 动物体质量及肾脏指数测定

用生理盐水冲洗肾组织并用吸水纸吸干后称重，计算大鼠的肾指数。大鼠肾脏指数(%)=肾质量(mg)/大鼠体质量(g)。

1.7 肾脏形态学变化观察

将上述称重后的左肾组织放在4%多聚甲醛固定液中24 h，常规经过脱水、固定、包埋、脱蜡、冲洗等步骤后苏木精-伊红(HE)染色，光镜下观察肾组织结构改变。

1.8 ELISA 法测定血清IL-6含量

股动脉采血留取的血液静置2 h后，2 500 r/min，离心10 min，制备血清。ELISA法测定血清IL-6的含量。具体方法参照试剂盒说明书进行。

1.9 RT-PCR观察肾脏Bcl-2、Bax和caspase-3的基因表达

右肾组织RNA提取用 4℃的Trizol试剂，提取后立即上机测定RNA含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR法合成模板cDNA后，以cDNA为模板进行PCR扩增反应，具体反应条件如下：95℃预变性2 min，95℃变性40 s，58℃退火50 s，60℃延伸2 min。共 42个循环。实验过程中每个样品至少设置3个复孔，以β-actin基因为内参基因，用 2-△△Ct来表示基因相对表达含量。

1.10 免疫组化法观察肾脏Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB 的蛋白表达

将脱蜡后的大鼠肾组织石蜡切片用3% H2O2进行封闭、然后经过微波修复、血清封闭，(1∶200、1∶100、1∶300、1∶200)的兔抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB一抗 4℃ 孵育过夜，(1∶1500)二抗37℃孵育、DAB显色等步骤完成免疫组化染色。染色判定依据为肾小管和肾间质胞浆出现棕色颗粒为染色阳性[6]。在显微镜下采集肾组织Bcl-2、Bax、Caspase-3和NF-κB的蛋白表达进行拍照。用免疫组化数据分析软件 Image proplus 6.0 对各组照片的染色结果进行分析，每组随机选取10张切片，每张切片连续选取3个不同视野，将10张切片中每张切片连续3个不同视野得出的光密度值再取其平均数即为平均积分光密度(integrated optical density，IOD)

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 黄芪汤对12C6+辐射脑损伤模型大鼠体质量及肾脏指数的影响

表2结果显示，单纯辐射模型组大鼠体质量和肾脏指数较正常对照组均明显下降(P<0.01)；黄芪汤高剂量组大鼠体质量和肾脏指数较单纯辐射模型组均显著升高(P<0.05)。

Tab. 2 Effects of Huangqi decoction on the weight and renal index in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.2 黄芪汤对12C6+辐射脑损伤模型大鼠肾组织形态学影响

图1结果显示，正常对照组肾小球和肾小管结构正常；单纯辐射组肾小球系膜细胞明显增生，肾小管间质血管明显扩张充血，肾小管管腔狭窄、不规则。黄芪汤低、中剂量组黄芪汤可见肾小球系膜细胞明显增生，肾小管间质血管明显扩张充血，肾小管排列紊乱；黄芪汤高剂量组可见肾小球系膜细胞增生情况明显改善，肾小管轮廓清晰。

Fig. 1 Effects of Huangqi decoction on the pathomorphological changes of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain (HE ×20)

2.3 黄芪汤对12C6+辐射脑损伤模型大鼠血清IL-6含量的影响

表3结果显示，与正常对照组比较，单纯辐射模型组大鼠血清IL-6含量显著升高(P<0.01)；与单纯辐射模型组比较，黄芪汤各干预组大鼠血清IL-6含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。

Tab. 3 Effects of Huangqi decoction on the serum content of IL-6 in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.4 黄芪汤对12C6+辐射脑损伤模型大鼠肾脏Bcl-2、Bax和caspase-3基因表达的影响

表4结果显示，单纯辐射模型组大鼠肾组织Bcl-2基因表达较正常对照组显著降低，Bax和caspase-3基因表达较正常对照组显著升高(P< 0.01)；黄芪汤各干预组大鼠肾组织Bcl-2基因表达较单纯辐射模型组显著升高，Bax和caspase-3基因表达较单纯辐射模型组显著降低(P<0.01)。

Tab. 4 Effects of Huangqi decoction on the gene expressions of Bcl-2, Bax and caspase-3 of renal tissue in rats induced by 12C6+ radiation n=10)

2.5 黄芪汤对12C6+辐射脑损伤模型大鼠肾脏Bcl-2、Bax 、caspase-3和NF-κB蛋白表达的影响

表5结果显示，与正常对照组比较，单纯辐射模型组大鼠Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01)，Bax、Caspase-3和NF-κB蛋白表达显著升高(P<0.01)；与单纯辐射模型组大鼠比较，黄芪各干预组大鼠Bcl-2蛋白表达显著升高(P<0.05，P<0.01)，中、高剂量组大鼠Bax、Caspase-3和黄芪各干预组大鼠NF-κB蛋白表达显著降低(P<0.05，P<0.01， 图2-5)。

Tab. 5 Effects of Huangqi decoction on the IOD vslue of protein expressions of Bcl-2, Bax, Caspase-3 and NF-κB of renal tissues in rats induced by 12C6+ radiation brain(IOD， n=10)

Fig. 2 Effects of Huangqi decoction on the Bcl-2 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 3 Effects of Huangqi decoction on the Bax protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 4 Effects of Huangqi decoction on the Caspase-3 protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

Fig. 5 Effects of Huangqi decoction on the NF-κB protein expression in rats induced by 12C6+ radiation brain(IHC ×20)

3 讨论

放疗是目前恶性肿瘤的主要治疗手段之一，其主要并发症是辐射性损伤。中医将这种辐射损伤归属于“热毒”范畴。中医认为热毒炽盛直中脏腑，消耗人体正气，导致气血亏虚，痰瘀血瘀、脏腑功能失调。治法以“补气生津、活血化瘀”为主。黄芪汤主要由黄芪 30 g、熟地黄15 g、麦冬15 g、人参15 g、枸杞子15 g，五味子10 g配伍而成。方中熟地黄、枸杞子具有滋补肝肾、滋阴清热功效；五味子具有滋肾养阴，益气生津功效；麦冬具有润肺清心，养阴生津功效；黄芪具有补中益气功效；人参大补元气，具有补脾益肺，生津养血功效。诸药合奏发挥益气滋阴，生津养血之功效。根据方解分析，黄芪汤对重离子辐射损伤能够起到防护作用。且有研究发现[7]，12C6+束照射大鼠辐射损伤模型的中医证候属性是气阴两虚证，黄芪汤对12C6+束照射导致的气阴两虚证具有明显的缓解作用，但是其具体的分子机制未明。

NF-κB是一个参与细胞凋亡与细胞增殖基因的转录，以及调控多种细胞因子转录的多功能转录因子，主要是以形成P50-P65 异源二聚体来发挥生理功能的。通常情况下，NF-κB 与 IκB 以三聚体的无活性方式存在于细胞浆中。当受到炎症因子(IL-1α、IL-1β)、细菌脂多糖、受损细胞释放的产物等刺激时，使三聚体中IκB发生磷酸化被蛋白水解酶水解，促进了NF-κB 的释放并转位进入细胞核，入核的NF-κB结合细胞核基因上的 κB 位点，又会调控一系列炎症性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-12 /23)、趋化因子 (IL-8、MIP-1α、MCP-1)、NO产物、黏附分子(ICAM、VCAM、E-选择素) 等的基因表达，调控机体的炎症反应和氧化应激反应[8-9]。IL-6是由T、B淋巴细胞及骨髓基质细胞分泌，主要介导炎症反应和机体免疫反应的多向潜能因子[10]，是判定炎症反应的常用指标之一。本研究结果表明，单纯辐射模型组肾小球系膜细胞明显增生，肾小管间质血管明显扩张充血，肾小管管腔狭窄、不规则。单纯辐射模型组体质量和肾指数均明显降低，IL-6含量和NF-κB蛋白表达明显升高，预先给予12C6+辐射脑损伤大鼠黄芪汤灌胃的结果显示，黄芪汤高剂量组大鼠的体质量和肾脏指数明显增加，肾组织病理损伤程度明显减轻，黄芪汤各干预组大鼠血清IL-6含量和肾组织NF-κB蛋白表达均明显下降。说明黄芪汤对12C6+辐射脑模型鼠诱发的旁效应器官肾病理损伤具有减缓作用，机制可能与抑制NF-κB信号通路的炎症因子IL-6的分泌有关。

受重离子照射的中枢神经系统极易引起周围靶器官的损伤，而肾脏是属于放射中枢神经系统旁效应靶器官损伤中最敏感组织。NF-κB介导的细胞凋亡通路的激活可能是引起肾损伤的关键因素。激活的NF-κB入核后可调控下游凋亡相关基因bcl-2、bax及细胞增殖相关基因Cyclin D1 的转录，从而发挥对细胞增殖、分化、凋亡及细胞周期的调控[11-12]。Bcl-2是属于Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白，Bax是属于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，Caspase-3是Bcl-2 家族通过线粒体途径调控细胞凋亡的下游促凋亡蛋白[13-15]。在线粒体凋亡调控通路中，当Bax形成Bax-Bax同源二聚体时会促进细胞凋亡，当Bax形成Bax-Bcl-2异源二聚体时会抑制细胞凋亡[15]。重离子辐射会激活机体受损组织的Bax过度表达，过度表达的Bax可通过线粒体途径激活下游的Caspase-3， 激发Caspase发生级联反应，促进受损组织的细胞凋亡[16]。从本实验结果看出，单纯辐射模型组大鼠肾脏的Bcl-2的基因表达和蛋白表达在12C6+离子辐射后7d均显著降低，而肾脏的Bax、Caspase-3的基因表达和蛋白表达及NF-κB的蛋白表达则在12C6+离子辐射后7d均显著升高，与以往的研究基本相符[5,17-18]；而预先给予黄芪汤干预的结果则显示，黄芪汤中、高剂量组肾组织的Bax和Caspase-3的蛋白表达均显著降低，黄芪汤各干预组肾组织的Bcl-2的基因表达和蛋白表达均显著升高、Bax和Caspase- 3肾组织的基因表达均显著降低，NF-κB肾组织的蛋白表达也均显著降低。说明，黄芪汤通过调控Bcl-2/NF-κB信号通路中的Bcl-2、Bax和Caspase-3，以其多药效部位多作用靶点的形式参与12C6+离子辐射后肾脏细胞凋亡，发挥其抗辐射损伤的作用。

综上，黄芪汤可能是通过调控NF-κB信号通路中Bcl-2表达水平的上调和Bax、Caspase-3、NF-κB的表达水平的下调，以抑制重离子辐射脑模型鼠受损肾的细胞凋亡，也可能是通过抑制NF-κB信号通路的炎症因子IL-6的分泌来抑制肾的炎症反应，从而进一步延缓受损肾组织的病理形态改变，发挥对辐射的干预作用。本文从NF-κB信号通路的凋亡和炎症反应的双向调控靶点上对黄芪汤的干预机制进行了初探，以期为辐射防护剂的研发提供新的思路。