谷氨酰胺对大鼠运动性疲劳的改善作用及其机制*

江 涛， 韦雪亮△， 肖书奇

(1. 广西大学体育学院， 南宁 530004； 2. 西北农林科技大学动物医学院， 陕西 杨凌 712100)

谷氨酰胺是合成蛋白质的22种氨基酸之一，在人和动物的血液中含量非常丰富，谷氨酰胺参与嘧啶碱、嘌呤碱、氨基糖等物质的合成，还可以作为一些分裂快速细胞的能源物质[1]。谷氨酰胺可转变为谷氨酸，有转氨和提供氮源的作用[2]。大量运动后肌肉中乳酸、肌酸激酶、乳酸脱氢酶等增多，使骨骼肌酸痛，同时还导致机体内源性氧自由基产生增多，运动员产生疲劳感，影响运动员的体力恢复和运动能力，最终影响运动成绩[3]。因此，提高运动员机体的抗氧化能力，尽快解除疲劳状态，提高其运动能力是一项需要解决的问题[4]。目前，谷氨酰胺在改善运动性疲劳方面的作用已经被部分研究报道[5]，但其改善运动性疲劳的机制仍不清楚，且相关报道较少，明确谷氨酰胺改善运动性疲劳的效果及机制对体力恢复、解除疲劳和挺高运动能力具有重要意义。本研究采用谷氨酰胺对大鼠进行干预，旨在探究谷氨酰胺抗运动疲劳、骨骼肌氧化以及肝脏细胞凋亡的效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性SD大鼠20只，体重180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供。各组大鼠自由进食和饮水，鼠房环境保持温度22～25℃ ，相对湿度35%～40%，12 h光照/黑暗交替。

1.2 主要试剂

谷氨酰胺购自Invitrogen公司；ELISA检测试剂盒购自上海国药集团化学试剂有限公司；电化学发光试剂盒购自天根生化科技有限公司；荧光实时定量PCR检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；Bcl-2和Bax引物委托宝生物(大连)工程有限公司合成。

1.3 模型建立与分组

适应性喂养 1 周后，将大鼠随机分为对照组和谷氨酰胺干预组，每组10只。谷氨酰胺干预组大鼠采用每天1 g/kg谷氨酰胺灌胃约2 ml,溶剂为生理盐水，对照组大鼠以同体积生理盐水灌胃，持续7 d。

1.4 力竭试验

将大鼠投入200 cm×100 cm×100 cm游泳池中游泳，水深为80 cm，水温为(25±2)℃，使大鼠游泳直到力竭，即大鼠沉入水下10 s以上不能上浮，且不能进行翻正反射。

1.5 样品采集

力竭试验结束后，禁食不禁水12 h，处死大鼠，腹主动脉取血5 ml 经3 000 r/min离心15 min，分离血清，-20℃冰箱冻存，用于谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、乳酸(lactic acid,LD)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平检测。迅速分离股四头肌，4℃预冷的生理盐水冲洗，滤纸拭干。以预冷的生理盐水作为匀浆介质，制成100 g/L肌肉组织匀浆，用于GSH、SOD和MDA检测。

1.6 抗氧化指标检测

采用ELISA检测血清及肌肉组织中GSH和MDA水平及SOD活力，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 血清乳酸水平检测

采用ELISA检测血清中乳酸(LD)水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.8 血清肌酸激酶及乳酸脱氢酶活力检测

采用肌酸激酶(CK)及乳酸脱氢酶(LDH)活力检测试剂盒测定血清中CK及LDH活力，严格按照试剂盒说明书操作。

1.9 肝组织Bcl-2和Bax mRNA表达水平检测

采用荧光实时定量PCR 检测肝组织中Bcl-2和Bax mRNA表达水平。常规提取肝组织总RNA，以GAPDH为内参照，按照试剂盒说明书进行RNA逆转录，并以此为模板进行PCR扩增。引物根据NCBI中的基因序列，通过Primer 5软件进行设计，的所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：GAPDH上游：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游：5’-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’；Bcl-2 上游引物为5’-CAAGAATGAAAGCACATCC-3’，下游引物为5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’；Bax上游引物为5’-GGCTGGCAAGGCCTGGT-3’，下游引物为5’-AGCCACAAAGATGGTCACTGTCT-3’。反应体系为25 μl,包括2.5×RealMasterMix/20×SYBR 溶液12 μl，上下游引物各1.0 μl，模板2 μl，无酶水9 μl。反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性 1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35个循环；72℃延伸5 min。进行PCR扩增时，每个样品均设3个平行重复。采用2-△△Ct方法计算目标基因表达相对水平。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 谷氨酰胺对大鼠力竭时间和力竭运动后血清CK、LDH活性及LH水平影响

如表1所示，谷氨酰胺干预组大鼠的力竭时间显著大于对照组(P<0.05)。谷氨酰胺干预组大鼠血清中的CK、LDH活性及LD水平均显著低于对照组(P<0.05)，表明补充谷氨酰胺可以降低大鼠组织细胞损伤，减少乳酸在血液中的堆积，减缓大鼠运动性疲劳。

Tab. 1 Effects of glutamine on rats’exhaustive time and serum CK, LDH activity and LH level after exhaustive n=10)

2.2 谷氨酰胺对大鼠力竭运动后血清、股四头肌匀浆中GSH水平的影响

如表2所示，谷氨酰胺组大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中GSH水平均显著高于对照组(P<0.05)，说明补充谷氨酰胺后，大鼠体内谷氨酸含量也随之升高，使得合成的GSH水平也升高。

Tab. 2 Effects of Glutamine on rats’GSH levels in serum and quadriceps femoris homogenate after exhaustive n=10)

2.3 谷氨酰胺对大鼠力竭运动后血清、股四头肌匀浆中SOD水平、血清、股四头肌匀浆中MDA水平的影响

如表3所示，谷氨酰胺组大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中SOD水平均显著高于对照组(P<0.05)，可能由于GSH的还原型将被自由基氧化的SOD还原，导致体内SOD水平出现升高。谷氨酰胺组大鼠力竭后，其血清及骨骼肌中MDA水平均显著低于对照组(P<0.05)。

Tab. 3 Effects of glutamine on rats’SOD levels in serum, quadriceps homogenate and MDA level in serum and quadriceps n=10)

2.4 谷氨酰胺对大鼠肝组织中Bcl-2 mRNA、Bax mRNA水平影响

如表4所示，谷氨酰胺干预组大鼠抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05)，而促凋亡基因Bax mRNA明显低于对照组(P< 0.05)。

Tab. 4 Effects of glutamine on rats’mRNA expression levels of Bcl-2 and Bax in livers n=10)

3 讨论

肌酸激酶也称为肌酸磷酸激酶，在骨骼肌和平滑肌中的含量较多，主要存在于细胞的细胞质和线粒体中，与细胞内能量运转、肌肉收缩和ATP再生有直接关系[6]。乳酸脱氢酶几乎存在于所有组织中，以骨骼肌中含量最丰富，有五种同工酶。有研究表明，机体进行大量运动时，血清和骨骼肌中的CK、LDH和LD的含量都会增加[7]。可能是由于机体大量运动时，组织器官的自由基增多，细胞膜的脂质双分子层发生过氧化反应，损害了细胞膜的完整性，使得细胞膜对CK和LDH的阻挡作用减弱，CK、LDH和LD从细胞膜内流向膜外，导致血清中的含量升高[8]。机体进行大量运动时，由于机体供氧相对不足，会使得三羧酸循环释放的能量不足以供肌体需求量，因此，无氧呼吸作用加快，产生大量的LD，致使血液中LD水平升高[9]。本研究结果表明，喂食谷氨酰胺的大鼠血清中CK和LDH的活性和LD含量较低，而且其力竭时间也较长，提示给大鼠补充谷氨酰胺可以在一定程度上降低组织细胞的损伤，减少乳酸在血液中的堆积，减缓大鼠的运动性疲劳。谷氨酰胺是一种效力较强的抗氧化剂，是由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的三肽复合物[10],可显著降低机体自由基产生，还能提高细胞膜稳定性[11]，因此可以改善机体氧化还原能力，而CK、LDH和LD为机体运动时增多自由基破坏细胞膜产生，故给予谷氨酰胺后可抑制自由基产生，提高细胞膜稳定性，降低细胞损伤，使得小鼠CK、LDH和LD水平降低。

SOD在肌体中广泛存在，其底物为氧自由基，具有唯一性和专一性，可以催化2O-2和2H形成H2O2，并在过氧化氢酶作用下分解为H2O和O2而被消除，是细胞膜系统结构和功能完整性的保护酶[12]。MDA是脂质氧化终产物，会加剧细胞膜的受损程度，还可以影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性[13]。机体大量运动时会对组织器官产生震荡效应，使细胞内代谢产物不断积累导致其渗透压升高，由于细胞膜通透性的可逆性变化，胞内代谢酶逸出，导致血清酶活性升高[14]。本研究结果表明，谷氨酰胺组大鼠力竭后，其血清和骨骼肌中GSH和SOD水平升高，同时MDA降低，提示谷氨酰胺可改善大鼠氧化还原能力。分析原因，GSH是体内一种重要的抗氧化剂，它既可以作为催化过氧化物还原的供氢体，也可以是亲电子物质结合的解毒剂，清除过量MDA、H2O2等，其有效成分谷氨酸可促进GSH水平升高，还原被自由基氧化的SOD[15]，此外，MDA作为脂质分解的终产物，谷氨酰胺保护了细胞膜，抑制细胞膜被脂质分解，故降低MDA水平[15]。

肝细胞凋亡是引起肝脏疾病和肝脏损伤的重要原因之一。细胞凋亡是细胞的程序性死亡，是一个主动过程，由基因控制[16]。有研究表明，谷氨酰胺可以通过抑制相关基因的表达来抑制肝细胞的凋亡[1]。减少肝细胞凋亡可以保护肝脏的完整性，对于维持机体的健康状态具有非常重要的意义。Bc1-2是凋亡抑制基因，Bax是凋亡诱导基因，其转录产物Bc1-2的高表达和Bax的低表达，可以抑制肝细胞凋亡[17]。本研究结果显示，喂食谷氨酰胺的大鼠血清中Bc1-2 基因表达水平较高，Bax 基因表达水平较低，表明谷氨酰胺具有抑制肝细胞凋亡的作用。这可能是由于谷氨酰胺上调Bc1-2在肝细胞中的表达，下调Bax在肝细胞中的表达。谷氨酰胺抑制肝细胞凋亡的机制尚不清楚，既往研究认为，谷氨酰胺可通过抑制线粒体凋亡途径抑制肝细胞凋亡[18]。还有研究认为，谷氨酰胺可提高肝细胞抗氧化能力，降低乳酸脱氢酶水平，减少微核肝细胞数目(被认为是DNA氧化损伤的关键分子)，起到保护肝细胞，抑制肝细胞凋亡[19]。既往研究认为凋亡相关因子表达较肝细胞死亡更早出现[17]，且大鼠年龄不同肝脏凋亡情况不一，故本研究观察了谷氨酰胺对Bc1-2、Bax表达影响，后续可深入探讨谷氨酰胺对肝细胞凋亡的影响及具体机制。

目前改善运动性疲劳的治疗方法有限，既往研究多集中于观察谷氨酰胺对疲劳的改善作用，而对于运动性疲劳，谷氨酰胺的作用机制及对细胞周期影响报道少见，本研究证实谷氨酰胺可通过改善机体氧化还原能力，保护骨骼肌及肝脏细胞，具有重要意义，对临床药物研发及深入了解谷氨酰胺对细胞功能影响具有一定指导意义。

综上所述，谷氨酰胺可以调整大鼠生理状态，缓解其运动性疲劳，其机制可能与增强机体抗氧化能力，降低其骨骼肌氧化程度，减缓其肝脏细胞凋亡有关。