筒鞘蛇菰提取物蛇菰多糖对D-半乳糖诱导大鼠肝损伤的保护作用及其机制*

张 桃， 谢 雅， 陈 颖， 夏德尧， 赵方毓， 陈显兵△， 樊孝琼△

(1. 湖北民族大学附属民大医院病理科， 2. 湖北民族大学医学部， 恩施 445000)

急性肝损伤是指在较短时间内发生的肝细胞损伤。目前，我国急性肝损伤患者主要以药物性肝损伤为主，且发病率逐年增加。肝脏作为机体以代谢功能为主的重要器官，某些药物在肝内药物代谢酶的作用下，产生自由基及其他代谢产物，与肝细胞的ATP等小分子结合，可攻击脂质和蛋白质，使机体内活性氧簇生成增加，引起脂质过氧化反应，导致肝细胞损伤[1-2]。研究发现许多中药含有抗氧化应激及抗炎成分，能够通过抑制脂质过氧化和炎症反应来发挥保肝作用[3]。因此，寻找防治肝损伤的中药并深入探讨其作用机制，对于推动中药发展及开发其利用具有重要意义。

筒鞘蛇菰( Balanophora involucrata Hook.f.，BIH)别名红菌、葛菌，是蛇菰科(Balanophoraceae)蛇菰属(Balanophora)植物[4-5]。又名文王一枝笔、借母怀胎或鸡心七。是武陵山地区和神农架林区的名贵药材，民间医生用其治疗肝炎、消化道出血和醉酒等病症。其主要成分为蛇菰多糖，具有提高免疫力、抗肿瘤、降血压、降血脂及抑制癌细胞生长等药理作用[6]。本研究采用D-gal建立小鼠肝损伤模型，用蛇菰多糖对其进行干预，并观察蛇菰多糖对D-gal诱导的肝损伤大鼠的保护作用，并初步探讨其对肝损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及仪器

水合氯醛、二甲苯、无水乙醇:天津市福晨化学试剂公司。苏木素染剂:福州迈新生物技术公司。ELISA试剂盒:上海碧云天生物技术有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛( malondi-aldehyde, MDA)试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司。Cleaved-Caspase-3 、Bax、Bcl-2和βactin抗体 ( Abcam 公司)。Western blotting其余试剂:上海碧云天生物技术有限公司。TC-120型智能程控生物组织自动脱水机、TB-718E型生物组织自动包埋机:湖北泰维科技实业有限公司。全波长酶标仪:美国THERMO FISHER公司。Western blot仪:美国BIO-RAD公司。

1.2 筒鞘蛇菰多糖的提取

筒鞘蛇菰全株于2018年夏季采自湖北省恩施市望城坡，经湖北民族大学药用植物分类与鉴定实验室鉴定为蛇菰科蛇菰属植物。洗净后50℃烘干，捣碎成粗粉后称取500 g，加入5 L去离子水，浸泡4 h，加热煮沸提取60 min，过滤，滤渣再分别加去离子水5 L和4 L，同法加热煮沸提取2次，过滤，合并滤液，并于40℃减压浓缩至1 L。浓缩液加入无水乙醇，使乙醇的体积分数达90% , 4℃静置过夜。离心分离沉淀，沉淀部分加水0.5 L搅拌，离心，沉淀部分再同法操作2次。合并上清液，将3次沉淀合并加水溶解后，离心除去不溶物，滤液减压浓缩，搅拌后离心收集沉淀，无水乙醇洗涤3次，50℃烘干，得蛇菰粗多糖。Sevage法脱蛋白，将所得蛇菰粗多糖配成5%水溶液，加入1/4体积的氯仿-正丁醇混合溶液,振摇30 min，离心15 min(5 000 g)，弃下层沉淀，收集上清，反复3次。混合上清液装入即用型透析袋(相对分子质量： 1 000；级别： RC膜S/P6)，蒸馏水透析48 h，冻干，得BIH。苯酚-硫酸法测定其中多糖含量为61.3%。

1.3 实验动物、分组与处理

健康雄性SD大鼠60只，10周龄，体质量在180～220 g，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK(鄂)2015-0018。随机分为正常组(Control)、模型组(D-gal)、 蛇菰多糖低剂量组(D-gal+50 mg/kg BIH，BIH-L)、蛇菰多糖中剂量组(D-gal+100 mg/kg BIH,BIH-M)、蛇菰多糖高剂量组(D-gal+200 mg/kg BIH,BIH-H)，每组12只。正常组大鼠每天颈背部皮下注射相同剂量生理盐水；模型组和蛇菰多糖各剂量组每天颈背部皮下注射 100 mg/kg的 D-gal。正常组和模型组每天2 ml生理盐水灌胃，蛇菰多糖各剂量组每天用对应浓度的蛇菰多糖灌胃，每次2 ml，连续42 d。实验动物正常进食和饮水，分笼伺养，自然光照周期，维持室温24℃ ,湿度56%左右。实验动物操作均符合动物伦理委员会制定的实验动物操作标准，接受湖北民族大学动物伦理委员会的监督与检查。

1.4 血清检测

42 d后，大鼠禁食12 h后，每组取大鼠6只，用10%水合氯醛3 ml/kg对大鼠腹腔注射后，固定于操作台，暴露心脏，用取血管抽取心脏血液，静置2 h，离心20 min，抽取上清液，然后放在4℃的恒温箱中，按照说明书测定丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransfease, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、直接胆红素(direct Bilirubin，DBIL)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

1.5 HE染色

实验42 d后，各组取6只大鼠，用10%水合氯醛3 ml/kg对大鼠腹腔注射后，固定于操作台，暴露心脏，先用250 ml生理盐水进行心脏灌流，再用4%多聚甲醛灌注直至四肢僵硬，取肝脏组织放于4%多聚甲醛液中浸泡保存，然后梯度脱水透明，常规石蜡浸蜡包埋，切片，在光学显微镜下观察不同组肝脏组织的形态学改变，余下取新鲜肝组织进行相关指标检测。

1.6 免疫荧光TUNEL法细胞凋亡检测

按一步TUNEL法原位细胞凋亡检测试剂盒(碧云天)说明书进行操作，以核绿色为阳性，每张切片随机选取 10 个视野(×400)，观察凋亡细胞，计算凋亡指数。凋亡指数(apoptotic index, AI)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.7 Western blot检测

各组取6只大鼠，取肝脏，制备蛋白样品，用BCA试剂盒蛋白定量测定蛋白浓度，根据测定加5×和1×蛋白上样缓冲液，然后将样品置于100℃的水中煮5 min ,放入-20℃冰箱冷存。根据说明书，制12%的下层胶和5%的上层胶，并配好电泳液和1×转膜液，蛋白加样，SDS-PAGE电泳，切胶，提前将PVDF膜放甲醇中浸泡2 min，转膜，用5%脱脂牛奶室温摇床封闭4 h, 1×TBST洗3次，每次8 min，加β-actin(1∶1 000), Bcl-2(1∶1 000), caspase-3(1∶1 000), Bax(1∶1 000)一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次8 min，加相应二抗(1∶4 000)室温摇床孵育2 h, TBST洗3次，每次5 min, ECL发光检测，Image J软件分析条带，以β-actin为内参。

1.8 统计字处理

2 结果

2.1 蛇菰多糖对肝损伤大鼠肝功能的影响

与正常组比，模型组大鼠血清 ALT 和 AST、DBIL水平显著升高(P<0.01)；蛇菰多糖处理组动物血清 ALT、 AST、DBIL水平显著低于模型组(P<0.01，表1)。BIH-L组的DBIL比BIH-M组高，BIH-H组的AST水平要高于BIH-M组，提示蛇菰多糖中剂量组保护效果较好。

Tab. 1 Effects of BIH on liver function changes of experimental n=6)

2.2 蛇菰多糖对肝损伤大鼠肝组织形态的影响

正常组大鼠肝脏红润，表面光滑，富有弹性，并无病变;模型组肝脏泛黄，表面粗糙，并伴有明显的颗粒状，而蛇菰多糖组的肝脏明显改善。显微镜下观察可见，正常大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐有序，结构完整，无病理变化出现;模型组肝小叶结构受损，肝细胞排列紊乱，并出现细胞肿胀、变性、坏死。蛇菰多糖组干预后受损程度明显改善(图1)。模型组肝细胞凋亡数量明显比正常组增多(P<0.05)，蛇菰多糖干预后明显降低(P<0.05),其中蛇菰多糖中剂量组效果最好。

Fig. 1 Effects of BIH on liver histopathological changes of rats (HE ×200)

2.3 蛇菰多糖对肝损伤大鼠血清 SOD活性和MDA 含量的影响

与正常组比，模型组、蛇菰多糖组大鼠血清 SOD 水平显著降低(P<0.01)，而血清 MDA 水平显著升高(P<0.05)；蛇菰多糖组处理组大鼠血清SOD 水平显著高于(P<0.01)，而血清 MDA水平显著低于模型组(P<0.05)；中、高剂量蛇菰多糖组大鼠血清 SOD 水平显著高于低剂量蛇菰多糖组(P< 0.01)，而 MDA 水平显著低于低剂量蛇菰多糖组(P<0.01，表2)。

2.4 蛇菰多糖对肝损伤大鼠肝细胞凋亡的影响

光学显微镜下，实验组及正常对照组肝脏内，凋亡阳性细胞呈绿色。正常组及干预组大鼠肝组织偶见细胞凋亡。与正常组比较模型组凋亡指数增加(P<0.01),BIH干预后与模型组比较AI指数明显下降(图2，表3)。

Fig. 2 Effect of BIH on liver apoptosis of rats(IF ×200)

Tab. 2 Effects of BIH on serum levels of SOD and MDA in n=6)

2.5 蛇菰多糖对caspase3、bax、bcl2的影响

造模干预 6周后，提取各组大鼠肝组织，Western blot 检测大鼠肝组织 Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达水平。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中的Caspase-3、Bax 蛋白表达水平上升(P<0.05) ，Bcl-2 蛋白表达水平下降(P<0.05)；与模型组相比，蛇菰多糖组大鼠肝组织中的Caspase-3、Bax、蛋白表达水平下降(P<0.05),Bcl-2 蛋白表达水平上升(P<0.05 )。中剂量组与低、高剂量组比较Caspase-3、Bax、Bcl-2改善较明显(P<0.05图3, 表3)。

Fig. 3 Effects of BIH on the protein expressions of Bcl2, Bax, Caspase3 in rats

3 讨论

D-半乳糖作为磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂可引起肝损伤，可用于建立肝损伤动物模型[1]。D-半乳糖引起的肝损伤破坏肝细胞代谢，导致血清酶活性的特征性改变[7-9]。机体正常情况下，谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)存在于肝细胞线粒体中；

Tab. 3 Effect of BIH on expressions of caspase3, bax, bcl2 in liver of n=6)

肝细胞受损时，ALT、AST被释放出来，引起血清ALT、AST活性增高，故其活性的高低在一定范围内反映肝细胞损伤程度的大小[10]。SOD是机体内存在的天然抗氧化剂，能消除自由基进而阻止其与膜脂质、膜蛋白进行反应，故其活性的高低可间接的反映出机体清除自由基的能力。MDA是自由基进生物膜所产生的脂质过氧化产物,其在血清及组织中的含量可以反映脂质过氧化程度，从而间接的反映出细胞受自由基攻击和损伤的程度[11]。本实验结果显示，D-gal组ALT、AST和DBIL水平在血清中明显升高(P<0.01)，提示大鼠肝脏出现了损伤表明,本研究模型复制成功，蛇菰多糖干预后大鼠血清中ALT,AST和DBIL水平降低，肝组织损伤程度得到改善，提示蛇菰多糖具有保肝作用。模型组大鼠血清中SOD水平显著降低、MDA升高，提示模型组大鼠体内抗氧化系统不足;而蛇菰多糖干预后能够降低MDA的含量、升高SOD的活性，提示蛇菰多糖的保肝作用可能与抗氧化有关，其中以中剂量组效果最好。

在各种因素引起的肝损伤疾病中，肝细胞凋亡都起着重要的作用[12]。肝细胞凋亡是在生理或病理因素刺激下，启动细胞凋亡基因而发生的主动死亡，但当凋亡基因被过度激活，细胞凋亡加重，将导致机体受到不同程度的组织损伤和细胞损伤，严重影响机体的生物学功能。作为凋亡信号传导途径中重要的调控基因，Bax不仅能形成同聚体发挥促进凋亡作用，而且能与Bcl-2形成异源二聚体，抑制Bcl-2的抗凋亡作用。Caspase-3是凋亡过程中的关键酶，在凋亡信号传导中常作为公共凋亡效应分子发挥最后的枢纽作用，被称为‘死亡执行蛋白酶”[13-14]。当细胞受到损伤、增殖活性受到抑制或发生细胞凋亡时，Caspase-3蛋白表达水平均可升高[15-17]。本研究结果表明，与模型组相比，蛇菰多糖干预组Bcl-2表达量上升，Bax和caspase-3表达量下降，提示蛇菰多糖各剂量组对大鼠肝损伤有抑制作用，其中以中剂量组效果最佳。

中医学认为肝病的致病因素主要有疫毒、饮食或饮酒、湿热外邪、体虚劳倦及情志不畅等。筒鞘蛇菰具有疏肝理气、活血化瘀、清热利湿解毒等作用[18-20]，筒鞘蛇菰提取物蛇菰多糖具有抗氧化、抑制凋亡作用，这些功能与肝脏的保护作用关系密切。综上所述，研究筒鞘蛇菰的护肝作用机制，对开发中药治疗肝损伤具有重要的理论意义和实用价值，但是其切确机制有待进一步研究。