川楝素诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡及其机制*

徐兴军， 李珊珊， 刘 畅， 张伟伟， 张珍珠， 邵淑丽Δ

(1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院, 黑龙江 齐齐哈尔 161006; 2. 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室, 黑龙江 齐齐哈尔 161006)

近年来全球胃癌患者逐年大幅度增加，且死亡率极高[1]。目前，胃癌最常用的治疗方案仍是以手术加全身化疗为主[2]。然而，近年来研究发现，胃癌对常规化疗药物的耐受性极差，且预后效果不理想[3,4]。因此，迫切需要新的化疗药物。

川楝素(toosendanin, TSN)是一种四环三萜类化合物，从楝树的树皮或果实中提取的无色针状晶体，最初楝树在中国和印度生长，后来转移到世界各地[5]。据报道，川楝素具有杀菌，杀虫，抗炎等功能[6,7]。本实验前期结果表明，川楝素能降低CCNB1和 CCND1基因表达量，使细胞周期阻滞于G1期[8]。然而川楝素对人胃癌MGC-803细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。因此，本实验以MGC-803细胞为研究对象，探讨川楝素诱导胃癌细胞凋亡的作用及其机制，为川楝素的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料与试剂

人胃癌MGC-803细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所；川楝素粉末购自飞宇生物；血清购自以色列Biological Industries公司；RPMI 1640干粉购自美国Gibco公司；Bcl-2、Bax、Cyt c、APAF、β-actin一抗均购自北京博奥森生物技术公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗以及抗体稀释液均购自美国LI-COR公司。

1.2 细胞培养与实验设计

人胃癌MGC-803细胞于CO2细胞培养箱中培养，观察细胞生长状态进行传代。将人胃癌MGC-803细胞分为5组，每组3个复孔，采用氟尿嘧啶(5-FU)和0 nmol/L川楝素(TSN)分别作为阳性对照和阴性对照，其余三组分别加入终浓度为30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素。川楝素处理细胞48 h后，利用激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构变化；流式细胞术检测线粒体膜电位变化；酶标法检测Caspase-3和Caspase-9活性；利用qRT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Cytc和APAF-1 mRNA和蛋白水平。

1.3 细胞形态观察

培养至对数生长期，分别用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L氟尿嘧啶(5-FU)作用细胞 48 h，加入吖啶橙室温孵育2 min，以0 nmol/L TSN为阴性对照，5-FU为阳性对照，用激光共聚焦显微镜观察及拍照。

1.4 流式细胞术检测线粒体膜电位

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用细胞48 h，收集细胞，依次加入工作液(500 μl)和1×缓冲液(500 μl)，混匀后上机检测。

1.5 Caspase-3和Caspase-9活性检测

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用细胞48 h，收集细胞，加入100 μl细胞裂解液，3 000 r/min，15 min。依次加入缓冲液(120 μl)、样品(150 μl)和 AC-IETD-pNA(30 μl)，混匀，37℃避光孵育1 h，酶标仪检测A405指标。

1.6 qRT-PCR检测凋亡相关基因mRNA的表达

人胃癌MGC-803细胞经0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用48 h后，Trizol 提取总RNA，并反转录成cDNA。以cDNA为模板，凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Cytc和APAF-1基因的引物(表1)，β-actin为内参，进行qRT-PCR检测。每组实验重复3次，扩增结束后以2-ΔΔCt方法计算凋亡相关基因 mRNA相对表达量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.7 Western blot检测凋亡相关基因蛋白的表达

人胃癌MGC-803细胞经0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用48 h后，提取细胞的总蛋白，在沸水中煮5 min，使蛋白质变性。进行 SDS-PAGE凝胶电泳再转移到聚偏二氟乙烯膜 (PVDF)上，然后用脱脂奶粉封闭 1 h。4℃条件下一抗(1∶300)孵育过夜。磷酸缓冲液洗3次，避光 4℃条件下二抗 Ig G (1∶10 000)孵育1 h，磷酸缓冲液洗3次，扫膜。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 川楝素对MGC-803细胞形态的影响

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用人胃癌MGC-803细胞48 h，观察细胞形态结构用激光共聚焦显微镜(图1)。0 nmol/L处理组细胞大小均匀一致，包膜完整，分裂正常。各川楝素处理组细胞逐渐呈现染色体浓缩，高度聚集，部分细胞核裂解成碎片等凋亡形态，与5-FU对照组相比，50 nmol/L川楝素组细胞凋亡特征更明显。

Fig. 1 The cell morphology of human gastric cancer MGC-803 cells treated with TSN for 48 h under laser confocal microscope (acridine orange ×400， n=3)

2.2 川楝素对MGC-803细胞线粒体膜电位影响

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU作用人胃癌MGC-803细胞48 h，线粒体膜电位变化检测用流式细胞仪(图2)。与0 nmol/L处理组相比，各川楝素组线粒体膜电位显著降低(P<0.01)。且当川楝素浓度为50 nmol/L时，线粒体膜电位最低。与5-FU对照组相比，50 nmol/L川楝素组线粒体膜电位明显低于5-FU组(P<0.01)。

Fig. 2 The mitochondrial membrane potential of the MGC-803 cells treated with TSN for 48 h(n=3)

2.3 川楝素对MGC-803细胞Caspase-3和Caspase-9活性影响

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU处理人胃癌MGC-803细胞48 h。表2结果显示，与0 nmol/L TSN组相比，各川楝素处理组Caspase-3和Caspase-9相对活性均显著升高(P<0.01)，且50 nmol/L川楝素组Caspase-3和Caspase-9相对活性均显著高于5-FU组(P<0.01)。

Tab. 2 Effects of TSN on the activities of Caspase-3 and Caspase-9 in MGC-803 cells n=3)

2.4 川楝素对MGC-803细胞凋亡相关基因mRNA表达的影响

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU处理人胃癌MGC-803细胞48 h。表3结果显示，与0 nmol/L 处理组相比，各川楝素处理组Bax(P<0.01)、Cytc(P<0.01)和APAF-1 (P<0.01)mRNA表达量均明显增加，Bcl-2 (P<0.01)mRNA表达量明显降低(P<0.01)。

Tab. 3 Effects of TSN on mRNA expression levels of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells n=3)

2.5 川楝素对MGC-803细胞凋亡相关基因蛋白表达的影响

用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU处理人胃癌MGC-803细胞48 h。图3结果显示，与0 nmol/L 处理组相比，各川楝素处理组Bax(P<0.01)、Cytc(P<0.01)和APAF-1 (P<0.01)蛋白表达量明显增加，Bcl-2 蛋白表达量明显降低(P<0.01，表4)。

Fig. 3 Effects of TSN on protein expression levels of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells

Tab. 4 Effects of TSN on protein expression of apoptosis-related genes in human gastric cancer MGC-803 cells n=3)

3 讨论

近年来全球胃癌患者逐年增加，且死亡率极高。目前，临床上治疗胃癌的常用化疗药物主要是希罗达、5-氟尿嘧啶等，其毒副作用较大[9]。因此寻找毒副作用小，治疗胃癌效果好的化疗药物势在必行。川楝素为川楝子和苦楝皮提取物。已有研究表明，川楝素可以诱导人卵巢癌A2870细胞[10]和人肺癌A549细胞凋亡[11]。但川楝素是否能诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡尚未见报道。本实验用终浓度为0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU处理人胃癌MGC-803细胞48 h后，细胞凋亡现象明显，且线粒体膜电位随着川楝素浓度的增大而降低。

细胞凋亡是一种细胞有序主动的死亡，在生物学中至关重要[12]。研究表明细胞凋亡主要有三条通路：线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路[13]。其中线粒体途径中Bcl-2和Bax是最有代表性的凋亡相关基因，是调节细胞凋亡过程的分子开关，在凋亡中起着关键作用[14]。TSN可通过上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达诱导人肝癌细胞凋亡，该作用就涉及线粒体途径的参与[15]。线粒体途径受Bcl-2家族成员调控的同时还依赖Cytc因子的释放[16]。当Cytc被释放到细胞质中与APAF-1结合，激活Caspase家族中的Caspase-9，进而激活下游蛋白Caspase-3，来诱导细胞凋亡[17]。据报道，白花蛇舌草可通过增强Caspase-3、Caspase-9基因表达诱导人胃癌细胞MNK-45细胞凋亡[18]，白扁豆多糖可通过调节Bax-Bcl-2-caspase3通路，诱导胃癌细胞HGC-27和SGC-7901凋亡[19]。补肾壮督方含药血清通过促进Bax、Cytc和APAF-1基因的表达, 抑制Bcl-2基因的表达来诱导人髓核细胞凋亡[20]。本实验用0 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、70 nmol/L的川楝素和50 nmol/L 5-FU处理人胃癌MGC-803细胞48 h 后，Bax、Cytc和APAF-1的mRNA和蛋白水平显著升高，Bcl-2的mRNA和蛋白质水平显著降低，Caspase-3和Caspase-9的活性显著增强，提示川楝素可通过线粒体途径诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡。

综上所述，川楝素能够使人胃癌MGC-803细胞线粒体膜电位降低，上调Bax、Cytc和APAF-1基因表达，下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡，进而发挥抗胃癌的作用。