吸附无细胞百白破联合疫苗生产用菌种遗传鉴定

石艳红，杨爽，马天驰，吴小丽，程小玲，施金荣

（武汉生物制品研究所有限责任公司，湖北 武汉 430207）

0 引言

吸附无细胞百白破联合疫苗用于预防百日咳、白喉、破伤风疾病，武汉公司生产的吸附无细胞百白破联合疫苗具有较好的免疫原性及免疫持久性[1]，联合疫苗的使用不仅能产生相应的疫苗保护并且减少了接种次数。对于细菌类疫苗的生产，疫苗的免疫原性及免疫效果与菌种的遗传稳定性息息相关，因此，本文对生产用菌种破伤风梭状芽胞杆菌、白喉棒杆菌、百日咳博德特氏菌进行遗传学鉴定研究，监测菌株的遗传稳定性，从源头保证疫苗的质量[2]。

原核生物的rRNA按沉降系数分为16S、5S和23S rRNA3种，它们分别含有1540、2，900和120个核苷酸，23S核苷酸含量过多不易分析，几乎是16S核苷酸含量的两倍；5S没有足够的遗传信息并且核苷酸又太少；16S核苷酸长度适中信息量较大且易分析。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最常用和最有用的分子钟，功能与结构上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称[3]。16S rDNA约1500bp左右，细菌不同则可变区序列不同，由于恒定区序列基本保守，可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行种类鉴定。16S rDNA鉴定步骤包括细菌基因组DNA制备、16S rDNA特异引物PCR扩增、扩增产物DNA纯化测序、序列比对等步骤。是一种快速准确获得细菌种属信息的方法[4]。

1 材料与方法

1.1 材料菌株。破伤风梭状芽胞杆菌CMCC64008、白喉棒杆菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003均来源中检院。

1.2 主要试剂。高保真高扩增效率PrimeSTAR TM HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司；GOLDVIEW染料购自赛百盛；1KB DNA ladder购自Fermentas。

1.3 引物设计及合成。利用原核微生物16 SrRNA两端的保守序列，设计出正向引物序列：5'-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3'；反向引物序列：5'-AGAAAGGA GGTGATCCAGCC-3'，引物合成由金思瑞生物技术公司完成。

1.4 16S rDNA扩增模板的制备。分别取1支冻干保存的破伤风梭状芽胞杆菌CMCC64008、白喉棒杆菌CMCC38007、百日咳博德特氏菌CMCC58003在微生物限度实验室内复苏并用培养基培养一代，挑取菌落溶解于适量0.9%无菌氯化钠溶液中，将菌悬液浓度调整到109个菌/mL，将获得的菌液100℃水浴15 min后摇匀，取上清，作为PCR扩增模板[5]。

1.5 目的16SrDNA扩增。分别以破伤风梭状芽胞杆菌、白喉棒杆菌、百日咳博德特氏菌菌液为模板，扩增16S rDNA，破伤风梭状芽胞杆菌、白喉棒杆菌16S rDNA扩增反应条件：98℃变性10 s，52℃退火15 s，72℃延伸90 s，共30个循环；百日咳博德特氏菌16S rRNA扩增反应条件：98℃变性10s，66℃退火5 s，72℃延伸90 s，共30个循环，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，紫外分析仪下观察结果。并将扩增产物送金思瑞生物技术公司纯化测序[6]。

2 结果

16SrDNA扩增产物凝胶电泳结果。用紫外分析仪观察到16S rDNA扩增产物产物在1500bp处有单一且很亮条带[7]，见图1。

图1 各细菌16SrDNA扩增产物凝胶电泳图

2.2 各细菌16S rDNA测序结果与基因库已知同种类序列比对结果，同源性均为99%。

3 讨论

随着生物技术的发展，体现出传统的微生物鉴定方法的局限性，基于基因的分子鉴定方法已被广泛应用。16S rDNA的序列包含9或10个可变区和11个恒定区[8]。生物物种间的亲缘关系由保守序列区域来反映，物种间的特异性通过高变序列区域来体现。根据细菌的16S rDNA中的序列设计出通用物，通过PCR反应可以扩增出相关细菌的16S rDNA片段，这些引物不会与非细菌的DNA互补，仅对细菌是特异性的，通过不同的细菌16S rDNA可变区的差异来区分[9-10]。随着核酸测序技术的发展，16S rDNA序列已成为细菌基因鉴定的标准标识。越来越多已测定的16S rDNA序列被收入国际基因数据库中，通过16S rDNA序列进行细菌基因鉴定更加方便快捷[11]。

目前细菌的16S rDNA鉴定技术广泛应用于多行业研究领域，该技术可高效核酸提取和16S rDNA基因测序用于细菌群落鉴定，临床上用于疾病的诊断，可以快速准确诊断出病原菌，从而让病人得到有效的治疗，也用于细菌种属的鉴定，在疫苗研究领域用于保护性抗原基因序列的遗传稳定性研究[12]，该技术应用于疫苗生产用细菌的遗传鉴定的报道较少，随着菌种在相应的培养基中扩增，可能会有潜在污染的风险，污染的外源病毒或微生物会伴随复制，从而引起菌种的生物学特性或遗传稳定性发生变异，本文采用细菌的16S rDNA鉴定技术监测疫苗生产菌种遗传稳定性给疫苗安全有效提供了有力保障。

《中国药典》2020年版三部明确规定应建立生产用菌毒种主种子批基因序列背景资料[13]，作为生产疫苗用的菌种这样一种特殊生物材料，遗传稳定性是重要的质控指标[14]，也可预测和预警现有疫苗菌种对当前疾病流行株的防病效果。本研究对武汉公司无细胞百白破联合疫苗生产用菌种的16S rDNA的序列进行了测定，通过与GeneBank中同种类已知序列进行比对，同源性均为99%，说明这3种生产用菌种均是安全的，从基因水平上进一步说明武汉生物制品研究所生产的无细胞百白破联合疫苗是安全有效的。