虎杖苷对新生小鼠高氧肺损伤的保护作用研究Δ

安 敏，王帅道，袁东烨，何靓男

(电子科技大学医学院附属绵阳医院·绵阳市中心医院烧伤整形外科，四川 绵阳 621000)

虎杖苷是植物虎杖的提取物，主要作用包括镇咳、去痰、平喘、抗菌、清除自由基、调节血脂和降低胆固醇等[1-2]。本研究探讨了虎杖苷通过SPOCK2表达对新生小鼠高氧肺损伤的保护作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：SCR20B型冷冻离心机(日本HITACHI公司)；Mx3000P型Real time PCR仪器(美国Agilent公司)；DF-23B型凝胶扫描系统(英国UVP公司)；ABI9700型PCR扩增仪(美国ABI公司)；UV-1206型分光光度计(日本SHIMODZU公司)；GDS7600型水平式电泳仪(北京东方仪器厂)。

1.1.2 药品：虎杖苷购自南京泽朗医药科技有限公司，用DMSO溶液充分溶解，再稀释成所需的浓度。

1.1.3 试剂：小鼠正常肺上皮细胞mlE-12(美国ATCC公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)试剂盒购自上海碧云天生物科技研究所；实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自大连宝生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组：用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养小鼠正常肺上皮细胞mlE-12，置于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中，当细胞生长融合至80%～90%时，用传代细胞进行后续实验。正常培养的mlE-12细胞作为对照组；利用高氧刺激mlE-12细胞作为高氧组。用50、100和150 μmol/ml虎杖苷处理mlE-12细胞，再用高氧刺激，作为高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组。将pcDNA、pcDNA-SPOCK2转染至mlE-12细胞，再用高氧刺激细胞，作为高氧+pcDNA组、高氧+pcDNA-SPOCK2组。将si-NC、si-SPOCK2转染至mlE-12细胞，高氧刺激后，再用高剂量(150 μmol/ml)虎杖苷处理细胞，作为高氧+高剂量+si-NC组、高氧+高剂量+si-SPOCK2组。

1.2.2 ELISA法检测细胞炎症因子水平：各组细胞培养48 h后，提取上清液，ELISA法检测TNF-α、IL-1β和IL-6，实验步骤按照试剂盒的详细说明书进行。

1.2.3 化学法检测细胞MDA含量和SOD活性：各组细胞培养48 h后，提取上清液，MDA含量采用改良的硫代巴比妥酸法测定，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定，详细实验操作按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测细胞SPOCK2 mRNA表达：各组细胞培养48 h，提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，按照荧光定量试剂盒使用说明进行PCR，每个样品设3个重复，循环条件为95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40个循环；60 ℃延长5 min。相对表达量用2-△△Ct法计算。SPOCK2以GAPDH为内参，SPOCK2上游引物为5′-CCATCGG TTGGATGTTCTCT-3′，下游引物为5′-TGTAGGTGTCGCA GGAGTTG-3′；GAPDH上游引物为5′-GCCCAGCAAGGATA CTGAGA-3′，下游引物为5′-GGGTGCAGCGAACTTTATTG-3′；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.5 蛋白质印迹(Western blot)法检测SPOCK2 蛋白质表达：各组细胞培养48 h，加入RIPA细胞裂解液提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒对提取的蛋白进行定量。进行SDS-PAGE电泳并分离蛋白，将分离的蛋白在转至PVDF膜上，于封闭液中封闭2 h。TBST洗涤后加入相应一抗，SPOCK2一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃过夜孵育，再加入1∶2 000稀释的二抗，室温(25 ℃)孵育2 h，TBST洗涤后，加入ECL试剂进行显色，于暗室显影、定影，使用Image J软件对图像进行分析，将β-actin作为内参，计算各组蛋白表达。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞氧化应激的影响

与对照组比较，高氧组细胞的MDA含量显著升高，SOD活性显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞的MDA含量显著降低，SOD活性显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞氧化应激的影响Tab 1 Effect of polydatin on oxidative stress of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

2.2 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞炎症因子的影响

与对照组比较，高氧组细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞的TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞炎症因子的影响Tab 2 Effect of polydatin on inflammatory factors of hyperoxic lung cells in neonatal n=9，pg/ml)

2.3 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞SPOCK2表达的影响

与对照组比较，高氧组细胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞的SPOCK2 mRNA和蛋白表达显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1、表3。

图1 相关蛋白表达图Fig 1 Diagram of expression of related protein

表3 虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞SPOCK2表达的影响Tab 3 Effect of polydatin on the expression of SPOCK2 of hyperoxic lung cells in neonatal n=9)

2.4 SPOCK2过表达对新生小鼠高氧肺细胞损伤的影响

与高氧+pcDNA组比较，高氧+pcDNA-SPOCK2细胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著降低，SOD活性显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 SPOCK2过表达对新生小鼠高氧肺细胞损伤的影响Tab 4 Effects of the over-expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

2.5 抑制SPOCK2表达对虎杖苷用于新生小鼠高氧肺细胞损伤的影响

与高氧+高剂量+si-NC组比较，高氧+高剂量+si-SPOCK2组细胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，SOD活性显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 抑制SPOCK2表达对虎杖苷用于新生小鼠高氧肺细胞损伤的影响Tab 5 Effects of the inhibition of expression of SPOCK2 on hyperoxia lung cell damage in neonatal mice n=9)

3 讨论

虎杖苷是从中药虎杖的干燥根茎中提取的第4种单体，属于芪类化合物，虎杖苷对肺微血管内皮细胞损伤具有一定的治疗效果，可起到保护肺部的作用。有研究结果表明，虎杖苷可以减轻肺部的病理损伤情况，抑制大鼠肺部氧化应激反应，抑制大鼠肺炎症介质释放[3]。张新彧等[4]的研究结果发现，虎杖苷对百草枯中毒造成的大鼠急性肺损伤具有保护作用。曹媛媛等[5]的研究结果认为，虎杖苷通过上调线粒体自噬，可以显著改善氧化应激介导的肺泡上皮细胞线粒体损伤。邓加雄等[2]的研究结果显示，虎杖苷通过激活SIRT3，可以显著改善脂多糖诱导的肺泡上皮线粒体损伤。曹堃[6]的研究结果显示，虎杖苷能够有效缓解电离辐射诱导的小鼠肺组织病理改变，减轻肺水肿。虎杖苷还可以减少小鼠炎症细胞因子的释放，发挥放射性肺损伤防护作用。王雷琛等[7]的研究结果显示，虎杖苷可降低肺MDA含量，提高SOD活性，抑制肺组织中TNF-α、IL-6水平，从而减轻小鼠在高原缺氧环境下的肺组织损伤。本研究结果表明，与对照组比较，高氧组细胞MDA含量显著升高，SOD活性显著降低；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞MDA含量显著降低，SOD活性显著升高。与对照组比较，高氧组细胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低。

SPOCK2表达与许多疾病的发生发展密切相关，有研究报道，SPOCK2基因与支气管肺发育不良具有非常重要的关系[8-10]。本研究结果发现，与对照组比较，高氧组细胞SPOCK2 mRNA和蛋白表达显著降低；与高氧组比较，高氧+低剂量组、高氧+中剂量组和高氧+高剂量组细胞SPOCK2 mRNA和蛋白表达显著升高。陈涛等[11]的研究结果表明，与对照组比较，高氧组大鼠肺组织中SPOCK2 mRNA和蛋白表达量显著降低。张媛[12]的研究结果表明，LncRNANANCI-NKX2.1信号通路下调可能参与高氧诱导新生小鼠肺损伤的发病机制。

本研究结果表明，与高氧+高剂量+si-NC组比较，高氧+高剂量+si-SPOCK2组细胞的MDA含量和TNF-α、IL-1β、IL-6水平显著升高，SOD活性显著降低。抑制SPOCK2表达逆转了虎杖苷对新生小鼠高氧肺细胞损伤的抑制作用，使氧化应激和炎症因子水平升高。说明虎杖苷通过上调SPOCK2表达，抑制新生小鼠高氧肺损伤。类似研究结果发现，谷氨酰胺通过ERS途径减轻高氧诱导新生大鼠肺组织水肿及炎症反应[13]。朱晓丹[14]的研究结果发现，白藜芦醇通过降低活性氧和p53的表达，减轻高氧诱导的新生大鼠肺组织凋亡。

综上所述，虎杖苷通过上调SPOCK2表达抑制新生小鼠高氧肺损伤，对肺部具有保护作用。