复方灵芝对小鼠镇静催眠作用的研究及机制初探

陈春玲，梁大红，田 佳，陈文双，张新乐，许碧莲，许卫铭，吴 铁，陈光华

(1.广东医科大学药学院，广东 湛江 524023;2.广东医科大学附属医院，广东 湛江 524023)

失眠在临床医学上称为“睡眠障碍”，睡眠障碍指睡眠-觉醒过程中表现出来的各种功能障碍，导致睡眠质量下降[1]。睡眠障碍还可以导致器官功能的改变，如认知功能、免疫功能、内分泌功能等[2]。治疗失眠症最常用且有效的方法是应用苯二氮卓类和巴比妥类药物，由于安全性低，巴比妥类药物已逐渐退出镇静催眠药市场，依然活跃在市场的苯二氮卓类药物因为潜在的药物依赖性仍属精神药品管理范围，处方受限制[3]。所以，研发无毒副作用的镇静催眠类食品尤为必要。灵芝(Ganodermalucidum,GL)用于治疗失眠已有数百年历史[4]，本试验复方灵芝是以赤灵芝为主药的基础上，辅以同样具有安神效果的茯苓、酸枣仁组成中药复方，进一步验证其镇静催眠效果并初步探讨机制。

1 材料与方法

1.1 试验药品 (1)复方灵芝：由赤灵芝、茯苓、酸枣仁三味中药组成，试验时用蒸馏水加热提取10 min，浓缩到42%，备用。(2)阳性对照药：艾司唑仑(山东信谊制药有限公司，批号:151214)，试验时用蒸馏水配制成1.3%的水溶液备用。(3)戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：WS20060401)，各浓度戊巴比妥钠溶液的溶剂为蒸馏水。(4)小鼠γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司，批号：201607),谷氨酸(Glutamate，Glu)ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司，批号：201607)，谷氨酰胺(Glutamine，Gln)ELISA检测试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司，批号：201607)，5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司，批号：201607)，5-羟色胺(5-HT)ELISA试剂盒(江苏晶美生物科技有限公司，批号：201607)。

1.2 实验动物 SPF级昆明小鼠60只，雄性，体重26～30 g，由广东医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2015—0147，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013—0008。各动物在常温安静动物室环境下正常饲养。

1.3 主要仪器 玻璃匀浆器，高速冷冻离心机YY/T0657-2008(湖南赫西仪器公司)，全自动酶标仪VT05404-0998(美国伯腾仪器公司)。

1.4 试验方法

1.4.1 阈下剂量戊巴比妥钠协同作用下复方灵芝的镇静催眠作用 30只小鼠试验前在实验室适应性喂养7 d后，随机分为3组：空白对照组、阳性药物组、复方灵芝组，每组10只，分别给予蒸馏水、0.13%艾司唑仑水溶液、复方灵芝水提液，除复方灵芝水提液每天0.3 mL/(10 g·bw)灌胃，其余每天0.2 mL/(10 g·bw)灌胃。连续给药8 d，在第7天给药灌胃给予对应药物60 min后，按参考文献[5]方法，考察30 min内入睡小鼠只数(翻正反射消失1 min 以上)。

1.4.2 阈上剂量戊巴比妥钠协同作用下复方灵芝的镇静催眠作用 30只小鼠按“1.4.1”项下分组方法及给药剂量，末次给药60 min后，各组小鼠分别腹腔注射阈上剂量戊巴比妥钠[40 mg/(kg·bw)，0.1 mL/(10g·bw)，参考文献[5] 和预试验结果]。记录小鼠的睡眠潜伏期及睡眠持续时间。

1.4.3 复方灵芝对失眠模型小鼠脑组织Gln、Glu、GABA、5-HIAA 和5-HT含量的影响 各组小鼠在第8天末次给药60 min后给予阈剂量戊巴比妥钠，禁食12 h，将所有小鼠断颈处死，迅速取出小鼠脑组织，用生理盐水冲洗后称质量，用匀浆器制备10%的脑组织匀浆，-4 ℃ 3 000 r/min离心10 min后取上清液，于-20 ℃低温保存。采用ELISA按照试剂盒说明书进行测量，测定各组小鼠脑组织中Gln、Glu、GABA、5-HIAA 和5-HT的含量。

2 结果

2.1 阈下剂量戊巴比妥钠协同作用下复方灵芝的镇静催眠作用 与空白对照组比较，复方灵芝组和阳性药物组小鼠入睡率极显著提高(P<0.01)。

表1 阈下催眠剂量戊巴比妥钠诱导小鼠入睡情况比较Table 1 Comparison of sleep induced by pentobarbital sodium at subthreshold hypnotic dose in mice (n=10)

2.2 阈上剂量戊巴比妥钠协同作用下复方灵芝的镇静催眠作用 与空白对照组比较，复方灵芝组和阳性药物组睡眠潜伏期明显缩短，阳性药物组睡眠持续时间明显延长，差异极显著(P<0.01)，复方灵芝组睡眠持续时间延长不明显(P>0.05)。结果见图1。

图1 阈剂量戊巴比妥钠对各组小鼠睡眠的影响Fig.1 Effect of threshold dose pentobarbital sodium on sleep in miceA:睡眠潜伏期;B:睡眠持续时间A:Sleep incubation period;B:Duration of sleep

2.3 复方灵芝对失眠模型小鼠脑组织Gln、Glu和GABA含量的影响 各组小鼠在第8天末次给药60 min 后给予阈剂量戊巴比妥钠，禁食12 h，将所有小鼠断头处理，迅速取出小鼠脑组织，用匀浆器制备10%的脑组织匀浆，采用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书进行测量，测定各组小鼠脑组织中Gln、Glu和GABA含量。与空白对照组比较，复方灵芝组小鼠脑内GABA含量增加，差异极显著(P<0.01)；阳性药物组、复方灵芝组的Glu和Gln含量均减少，差异极显著(P<0.01)。结果见图2。

图2 药物对小鼠脑组织中GABA、Glu及Gln的影响Fig.2 Effects of drugs on GABA,Glu and Gln in mouse brain tissueA：GABA；B：Glu；C：Gln

2.4 复方灵芝对失眠模型小鼠脑组织5-HIAA 和5-HT含量的影响 小鼠脑组织取样同上，然后采用酶联免疫吸附法按照试剂盒说明书进行测量，测定各组小鼠脑组织中5-HT和5-HIAA含量。与空白对照组比较，阳性药物组的5-HT含量增加，差异极显著(P<0.01)；但HIAA含量无明显变化。复方灵芝组的5-HT及5-HITT含量均无明显变化。结果见图3。

图3 药物对小鼠脑组织中5-HT及5-HITT的影响Fig.3 Effects of drugs on 5-HT and 5-HITT in mouse brain tissueA：5-HT；B：5-HITT

3 讨论

本试验结果表明，复方灵芝不但能显著缩短阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠的睡眠潜伏期，而且能提高阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠入睡率。复方灵芝导致阈下剂量的戊巴比妥钠小鼠入睡的只数与阳性药物组相当，无统计学意义；对阈剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠潜伏期和睡眠时间的作用不及阳性药物。结果提示，复方灵芝能协同戊巴比妥钠缩短入睡时间，延长睡眠时间，可用于入睡困难、反复易醒的失眠病人，有明显的镇静、催眠作用。

复方灵芝君药为灵芝，灵芝为担子菌纲灵芝属真菌，东汉《神农本草经》将灵芝列为上品，《中华人民共和国药典》收载灵芝(赤芝、紫芝)子实体为法定中药材。2000年版《美国草药药典和治疗概要》收载了灵芝。现代医学证明,灵芝含有多种生理活性物质,对人体免疫系统、中枢神经系统等具有良好的功效作用；研究已经证明，灵芝具有镇静、催眠等对神经系统的药理作用[4]，灵芝的改善睡眠作用是通过其中的灵芝多糖调节神经系统，从而影响松果体对褪黑素的分泌[6]，灵芝多糖还可以明显提高超氧化物歧化酶(SOD)活性[7],促进H2O2的清除,对羟自由基有清除作用,可明显清除机体产生的自由基,阻止自由基对机体的损伤,降低机体的疲劳感，因而,抗氧化作用可能是灵芝改善睡眠的作用机制之一；另外，灵芝对中枢神经系统有明显的镇静作用,能使动物的肌肉轻度松弛,自发性活动减少,还能协同巴比妥类药物的中枢抑制作用，但灵芝本身并无催眠作用，这也可能是灵芝改善睡眠原因之一。茯苓和酸枣仁皆为臣药，茯苓为多孔菌科卧菌属真菌的干燥菌核，是一种常用中药，始载于《本草经》，味甘淡，性平，有健脾补中、养心安神、利水渗湿的功能[8]。还有报道[9]显示，茯苓水提液可以改善东莨菪碱所致记忆获得障碍和30%乙醇所致记忆再现障碍2种模型小鼠的学习记忆能力。茯苓的抗惊厥和催眠作用机制[10]可能与增加GABA的表达和下调谷氨酸和天冬氨酸的水平有关。酸枣仁是鼠李科植物酸枣的种子成熟后经过干燥处理所得，其性平，味甘、酸，归肝、胆、心经，具有养肝、宁心安神、敛汗的功效[11]。酸枣仁是临床很常用的治疗失眠的中药，长期用于改善睡眠疗效显著[12]。最近的药理学研究确认，酸枣仁主要是通过改变5-HT 和GABA含量来影响睡眠，最终达到镇静催眠的效果。

Glu和GABA是中枢神经系统(CNS)中2种主要的氨基酸，GABA是CNS中最主要的抑制性递质，而Glu在CNS含量较高，是兴奋性递质。巴比妥类药物和抗癫痫药苯妥英钠均能增加GABA的神经功能，其机制可能与促进脑内GABA释放有关。为了初步探讨紫灵芝中枢抑制作用机制，本试验采用酶联免疫法测定了小鼠脑组织中GABA、Glu的含量，将神经递质的主要来源物质Gln作为观测指标。结果表明：复方灵芝明显提高小鼠脑组织中GABA的含量，降低小鼠脑组织中Glu及Gln的含量，提示该药的镇静催眠作用可能与增加CNS中GABA含量、减少Glu含量有关。提示药物可能通过增加抑制性递质GABA合成和增加兴奋性递质Glu代谢而起到中枢抑制的作用。但复方灵芝通过何种途径减少兴奋性神经递质Glu的含量增加抑制性递质的含量，是否与GABA受体有关还有待进一步研究。

临床资料显示，失眠患者也常伴有中枢神经递质5-HT 的降低，5-HT是参与了非快动眼睡眠时相，从而影响睡眠。而口服5-HT前体5-HTP后，5-HT含量增加，可促进睡眠。5-HT经代谢可生成5-HIAA，5-HIAA 的变化也可间接反映5-HT的变化。结果表明，而复方灵芝组小鼠脑内5-HT、5-HIAA 含量无明显变化，提示其作用机制与5-HT、5-HIAA的合成无关，对非快动眼睡眠时相无影响。

综上所述，复方灵芝有明显的镇静、催眠作用。可能通过增加中枢抑制性递质GABA合成和增加兴奋性递质Glu代谢而起到中枢抑制的作用。