新疆乌鲁木齐宠物源常见病原菌的耐药性调查

郭 菲，林亚军，王 凯，王舒丰，姚晓慧，马木尔·阿克木汉，夏利宁

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆阿勒泰职业技术学院，新疆 阿勒泰 836599)

随着宠物越来越多的进入人们的家庭生活，细菌交叉感染在宠物病中扮演着重要角色，由于宠物接触的抗菌药物与用于人类治疗的某些药物类似[1]，因此存在由宠物源耐药菌传递给人，致使人无药可用的风险。据统计，目前已发现通过动物传染给人类的疾病至少有816种，对动物疾病的预防和控制普及不到位，则会为疾病的传播埋下很多隐患[2]。欧美等发达国家开始重视小动物的细菌耐药问题，已报道许多有关宠物源细菌耐药性的研究[3]。国内对细菌耐药的研究主要在人医及畜禽临床用药方面，少见对宠物源细菌耐药性的研究报道。本试验通过调查宠物源大肠杆菌、沙门菌、葡萄球菌对常用抗菌药物的敏感性，为小动物临床合理使用抗菌药物提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 2015年冬季和2016年春季在乌鲁木齐市多家宠物医院采集样品，将灭菌肛拭子插入犬和猫的直肠采集新鲜粪便。共采集170份肛拭子样品，其中含有149份犬源样品，21份猫源样品，从样品中分离沙门菌、大肠杆菌、葡萄球菌。

1.2 菌株及培养基 大肠杆菌ATCC25922标准菌株和金黄色葡萄球菌ATCC29213标准菌株为质控菌，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。麦康凯培养基、普通肉汤和Mueller-Hinton(MH)培养基、琼脂粉、Nutrient Broth(NB)营养肉汤、氯化镁孔雀绿增菌液(MM)、SS琼脂、沙门菌显色培养基，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。Baird-Parker琼脂培养基，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

1.3 药物 β-内酰胺类：头孢噻呋(Ceftiofur，CEF)、苯唑西林(Oxacillin，OX)、阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/Clavulanic acid，A/C)和氨苄西林(Ampicillin，AMP)；四环素类：四环素(Tetracycline，TET)；安莎霉素类：利福平(Rifampicin，RA)；酰胺醇类：氟苯尼考(Florfenicol，FLR)；林可胺类：克林霉素(Clindamycin，CLDM)；氟喹诺酮类：诺氟沙星(Norfloxacin，NOF)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)、左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)；氨基糖苷类：卡那霉素(Kanamycin，KANA)、安普霉素(Apramycin，APR)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)和阿米卡星(Amikacin，AMK)，上述药品均购自中国兽医药品监察所，且均为标准品。

1.4 宠物源常见病原菌的分离鉴定 将采集粪样的肛拭子在1 mL灭菌MH肉汤中增菌，增菌液在麦康凯琼脂平板上划线并挑取单菌落做革兰染色镜检，进行大肠杆菌的分离；将采集粪样的肛拭子在含有7.5% NaCl的MH营养肉汤中增菌，增菌液在Baird-Parker琼脂培养基上划线，经革兰染色镜检及触酶试验，进行葡萄球菌的分离；将采集粪样的肛拭子在MM肉汤中增菌，在SS琼脂上划线并经PCR鉴定，进行沙门菌的分离，鉴定后的病原菌经60%甘油保菌于-20 ℃保存备用。

1.5 药敏试验及结果判定 按照美国临床实验室标准委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)[4]推荐的琼脂稀释法对分离的大肠杆菌、沙门菌和葡萄球菌进行临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentrations,MICs)值测定，以耐药、中介和敏感3种形式记录结果。

1.6 统计分析 采用SPSS 20.0软件进行耐药率差异统计，用卡方检验做差异显著性分析，结果以平均值±标准差表示，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 宠物源常见病原菌分离鉴定 在乌鲁木齐市5家宠物医院采集宠物肛拭子170份，对采集的样品进行葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌的分离，分离率分别为葡萄球菌90.6%(154/170)、大肠杆菌72.9%(124/170)和沙门菌25.9%(44/170)。

2.2 宠物源常见病原菌对抗菌药物的耐药性 宠物源大肠杆菌对环丙沙星(98.4%)、氨苄西林(97.6%)、氟苯尼考(92.0%)这3种药物的耐药率均在90.0%以上，对阿莫西林/克拉维酸(81.4%)、庆大霉素(75.8%)、恩诺沙星(71.0%)、诺氟沙星(70.2%)这4种药物的耐药率均在70.0%以上，对头孢噻呋(39.5%)、安普霉素(25.0%)、阿米卡星(12.0%)耐药率在40.0%以下。

宠物源葡萄球菌对苯唑西林(94.2%)耐药率较高，对四环素(60.4%)、氟苯尼考(58.4%)、氧氟沙星(57.1%)、克林霉素(55.8%)耐药率均在50.0%以上；对利福平和阿米卡星的耐药率较低，均在30.0%以下。

宠物源沙门菌对氟苯尼考、诺氟沙星、环丙沙星、四环素、卡那霉素这5种药物耐药率高达100%，对氨苄西林(95.0%)、阿莫西林/克拉维酸(97.7%)、恩诺沙星(93.0%)这3种药物耐药率均在90.0%以上，对庆大霉素、安普霉素、阿米卡星与头孢噻呋敏感率高。

卡方检验结果如表1所示，葡萄球菌分离株对阿米卡星、氟苯尼考耐药率显著高于大肠杆菌和沙门菌(P<0.05)；沙门菌和大肠杆菌分离株对恩诺沙星和阿莫西林/克拉维酸耐药率显著高于葡萄球菌(P<0.05)。此外，葡萄球菌分离株对阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考和恩诺沙星的中介率也显著高于大肠杆菌和沙门菌(P<0.05)。

表1 乌鲁木齐宠物源常见病原菌耐药结果Table1 Drug resistance results of common pathogens in pet sources in Urumqi (%)

2.3 宠物源常见病原菌多药耐药及耐药谱型 结果如图1所示，宠物源常见病原菌多药耐药情况严重，其中宠物源大肠杆菌以8耐为主，达到25.8%，其次是7耐和6耐，多药耐药率分别为17.7%和16.1%，并检出3株超级耐药菌株，对被检的10种抗菌药物都耐药；宠物源葡萄球菌多药耐药分布较广，在0～11耐均有分布，以4耐和6耐多药耐药为主，分别为15.0%和13.0%，检出8株超级耐药菌，对被检的11种抗菌药物都耐药；宠物源沙门菌多药耐药在6～10 耐分布，多药耐药以8耐为主，达88.6%。

图1 宠物源大肠杆菌、葡萄球菌及沙门菌多药耐药结果Fig.1 The multi-drug resistance results of Escherichia coli,Staphylococcus and Salmonella isolated from pets

耐药谱型结果显示，宠物源病原菌耐药谱型多样化，以葡萄球菌耐药谱型最多，154株葡萄球菌对被检的抗菌药物共检出81种耐药谱型，以2耐、4耐 和6耐为主，2耐谱型中以LEV-FLR为主，占3.9%(6/154)，4耐谱型中以TET-FLR-LEV-OX为主，占3.9%(6/154)，6耐谱型中以TET-FLR-LEV-OX-CLDM-CEF为主，占3.2%(5/154)；大肠杆菌谱型次之，共有40种谱型，以6耐、7耐和8耐为主，6耐 谱型中以AMP-FLR-A/C-ENR-NOF-CIP为主，占4.0%(5/124)，7耐谱型以AMP-FLR-A/C-GEN-ENF-NOF-CIP为主，占12.9%(16/124)，8耐谱型以AMP-FLR-A/C-GEN-CEF-ENR-NOF-CIP和AMP-FLR-A/C-APR-GEN-ENR-NOF-CIP为主，分别占8.9%(11/124)和11.3%(14/124)；而44株沙门菌仅有4种耐药谱型，以8耐谱型AMP-FLR-A/C-ENR-NOF-CIP-TET-KANA为主，占88.6%(39/44)。

3 讨论

本试验从同一批宠物粪便样本中进行宠物源常见3种病原菌的分离鉴定，结果显示：3种病原菌分离率从高到低依次为葡萄球菌(90.6%)、大肠杆菌(72.9%)、沙门菌(25.9%)，对葡萄球菌的分离率显著高于吴铁花等[5](10.7%)、郭立军[6](71.4%)和冯言言等[7](16.0%)的报道，其原因可能是不同报道中对葡萄球菌的分离鉴定方法不同。此外，乌鲁木齐市宠物源大肠杆菌的分离率显著高于其他地区的报道，文英等[8]报道的青海省宠物源大肠杆菌分离率为27.9%，吴萍萍[9]报道的安徽地区宠物源大肠杆菌的分离率为47.6%，本试验中宠物源大肠杆菌的分离率与刘果等[10]报道长春地区宠物源大肠杆菌分离率(70.4%)基本一致。造成分离率存在较大差异的原因可能是不同地区所采集的宠物健康状态不同。查阅相关文献可知，宠物源沙门菌的分离率整体较低，如陈传荣等[11](2.3%，17/746)、颜卫等[12](1.91%，13/682)报道的宠物源沙门菌的分离率均未超过5.0%，而李玉兰[13]报道的青海省宠物源沙门菌的分离率为18.8%(23/122)，本试验中宠物源沙门菌的分离率(25.9%，44/170)与龚大春等[14](27.8%，10/36)报道的基本一致。

宠物源不同病原菌对被检抗菌药物存在不同程度的耐药，多药耐药集中在6～8耐，耐药谱型多样化，整体耐药严重程度为沙门菌>大肠杆菌>葡萄球菌。44株宠物源沙门菌对被检的7种抗菌药物耐药率超过90.0%，本试验结果与林亚军等[15]报道的对阿米卡星、头孢噻呋的药敏试验结果一致，对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林耐药性结果与王元兰[16]报道的合肥地区宠物源沙门菌一致，但高于陈传荣等[11]报道的17株宠物源沙门菌对氨苄西林的耐药结果。124株宠物源大肠杆菌对被检的7种抗菌药物的耐药率在60.0%以上，部分抗菌药物耐药结果高于文英等[8]报道的百株宠物源大肠杆菌的耐药率以及吴立婷[17]报道的宠物源大肠杆菌的耐药率(6.9%72.2%)，与张美君等[18]报道的宠物源大肠杆菌对安普霉素、阿米卡星的耐药结果相符；但对头孢噻呋的耐药率低于师志海等[19]的报道，对阿莫西林/克拉维酸(73.6%)、头孢菌素(49.5%)、庆大霉素(87.9%)的耐药率则低于波兰Rzewuska等[20]报道的犬猫源大肠杆菌。154株宠物源葡萄球菌对被检的5种抗菌药物耐药率超过50.0%，宠物源葡萄球菌对苯唑西林的耐药率高达94.3%，与轩慧勇等[21]等报道的宠物源葡萄球菌对临床常用抗菌药物耐药结果一致，对克林霉素(55.2%)和四环素(59.7%)的耐药率低于冯言言等[7]报道的耐药率(对这2种抗菌药物的耐药率都超过80.0%)，对阿莫西林/克拉维酸的耐药率(48.1%)低于龚大春等[14]的报道(84.5%)。造成宠物源常见病原菌耐药情况及多药耐药率如此高的原因可能是家庭式饲养使宠物自身免疫力低，国家药物监管制度不完善，诊疗机构肆意加大药物使用剂量，导致宠物耐药情况日益严重。

综上可知，乌鲁木齐市宠物粪便中3种常见病原菌携带率较高，且沙门菌与大肠杆菌对部分被检抗菌药物的耐药率高达90.0%以上。宠物源常见病原菌多药耐药谱型宽，其中沙门菌多药耐药谱型集中在8耐，且检出8株对11种抗菌药物都耐药的超级耐药菌。表明新疆乌鲁木齐宠物源3种常见病原菌耐药情况较为严重，应加强宠物源菌耐药性的监控力度。此外，临床治疗中应避免重复使用同一种药物，规范使用抗菌药物，从而减少耐药细菌的产生和传播。