H9N2病毒感染影响小鼠肠道维生素D受体和钙离子通道蛋白mRNA的表达

连朋敬，吴韦洒，白江松，白 玉，牛小飞，李静云，张子卉，乔 健

(中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

肠道内钙离子的主动吸收主要由瞬时受体电位通道蛋白6(Transient receptor potential channel type 6，TRPV6)完成[1]。TRPV6属于瞬时感受器电位蛋白超家族，是Ca2+选择性的离子通道，参与维持体内钙稳态。钙离子在小肠上皮细胞刷状缘通过TRPV6的介导进入细胞，再由钙结合蛋白(Calcium binding protein，CaBP)由细胞刷状缘顶膜转移到基底膜，完成钙离子的吸收[2]。TRPV6在小肠上皮细胞内的表达受维生素D调节。维生素D通过结合细胞内的维生素D受体(Vitamin D receptor，VDR)，调节TRPV6基因的转录[3]。因此，VDR和TRPV6与肠道内钙离子的吸收密切相关。钙的缺失除了会导致骨质疏松外，还和高血压、心脏病、糖尿病和癌症等多种疾病的发生发展有关，特别是老年人，消化吸收能力弱，钙的吸收率下降，而老年人正是季节性流感的易感人群。然而，流感感染是否会影响到肠道对钙的吸收仍未可知。H9N2禽流感病毒是目前我国乃至世界范围内流行最广的流感病毒之一，不仅可以在家禽中稳定传播，还可以感染哺乳动物和人[4-6]。H9N2病毒主要侵犯呼吸系统，也可以造成肠道黏膜损伤[7]。本试验以滴鼻方法用H9N2病毒感染BALB/c小鼠，通过检测小鼠小肠组织中VDR和TRPV6 mRNA表达变化，初步探讨H9N2病毒感染和钙离子代谢之间可能存在的关系，为以后的相关研究提供一些思路和参考。

1 材料与方法

1.1 H9N2病毒 本试验所用的H9N2病毒是2008年本实验室从河北一组患病鸡群中分离获得。经过血凝血抑试验的鉴定，确定为H9N2亚型禽流感病毒，将其命名为 A/Chicken/Hebei/4/2008(H9N2)(GenBank 登录号为 FJ499463-FJ499470)。经实验室研究表明，该病毒为低致病性的禽流感病毒[8]。鸡胚繁毒后测定病毒毒力，当感染剂量为1×106TCID50时小鼠出现典型临床症状，并且在此接种量下死亡率较低，便于观察小鼠从感染发病到逐渐恢复的完整过程。

1.2 实验动物 60只5～6周龄、体重(20±2)g、雄性SPF级 BALB/c小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 动物感染及样本采集 BALB/c小鼠随机分组：H9N2感染试验组和无菌鸡胚尿囊液对照组各30只。将H9N2病毒鸡胚尿囊液用无菌生理盐水稀释到1×106TCID50，无菌尿囊液同等倍数稀释。小鼠异氟烷吸入麻醉后，试验组和对照组分别滴鼻接种稀释后的H9N2病毒鸡胚尿囊液和无菌尿囊液，100 μL/只。每天在固定时间点观察小鼠临床症状，包括体温、体重及采食量、精神状态和死亡情况。在H9N2病毒感染后的第3、7、14、21天和第28天 两组各随机取5只小鼠，称重，麻醉后脱颈处死，采集肺脏并称重。采集十二指肠，用无菌PBS清洗净十二指肠后，迅速将组织冻存于液氮中。

1.4 绝对荧光定量PCR检测 将组织在液氮中研磨成粉末状，于TRIzol裂解液中裂解。用组织样本基因组提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2094)，按照试剂盒说明书从组织样本中提取总RNA。采用琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收法测定RNA的质量。使用Primer 3.0软件设计引物，引物序列见表1，引物由Invitrogen公司合成。使用Thermo Script RT-PCR试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，目的片段进行琼脂糖凝胶回收。回收的PCR产物进行TA连接，转化感受态细胞DH5α，并进行菌落PCR阳性克隆鉴定，无误后，提取质粒进行测序鉴定，发现无任何突变，与目的基因序列一致，可作为绝对定量的标准品。用紫外分光光度计测定质粒OD260值，运用公式得到相应拷贝数。换算公式为质粒拷贝数(copies/μL)=质粒浓度(ng/μL)×6.02×1023/(质粒分子量×660)。将质粒标准品进行10倍梯度稀释，每个梯度取2 μL做模板建立标准曲线，并得出标准方程。将所有DNA样品进行Realtime PCR检测，每个样本做3个重复。VDR按以下程序进行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s，40个PCR循环。TRPV6按以下程序进行：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40个PCR循环。之后进行熔解曲线步骤。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.5 统计学分析 以Ct值为纵坐标，基因拷贝数为横坐标，用质粒标准品构建标准曲线。将样本DNA检测Ct值代入标准曲线方程得出样本DNA拷贝数。试验数据均使用SPSS 19.0软件处理，并分析组间差异(当P<0.05时，表示其在统计学意义上有显著性差异)。再使用GraphPad Prism 7进行图表绘制。所有试验数据都用平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 构建VDR和TRPV6基因标准曲线 以VDR和TRPV6的特异性的引物分别进行PCR反应后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，发现特异性条带位于103 bp和163 bp处，且产物单一，与预期大小一致，说明引物特异性强，可进行下一步试验(图1)。菌落PCR电泳鉴定结果条带分别处于103 bp和163 bp，与预期的2个目的片段的大小一致，说明电泳检测得到了目的片段，为阳性克隆(图2)。

图1 VDR(A)和TRPV6(B)基因PCR扩增结果Fig.1 The result of VDR(A)and TRPV6(B)gene amplification by PCR1:DNA相对分子质量标准；2～3:目的基因片段；4：阴性对照1:DNA marker;2-3:Target gene segment;4:Negative control

图2 阳性克隆菌落的PCR鉴定Fig.2 Identification of positive clone colony by PCR1:DNA 相对分子质量标准；2：VDR 目的片段；3～5：阴性对照；6：TRPV6目的片段1:DNA marker;2:VDR target segment;3-5:Negative control;6:TRPV6 target segment

构建好的质粒测序鉴定发现无任何突变，与目的基因序列一致。用紫外分光光度计测定质粒OD260值，运用公式得到相应拷贝数。VDR质粒拷贝数为1.02×1011拷贝/μL，TRPV6质粒拷贝数为1.06×1010拷贝/μL。分别以这2种质粒做标准曲线。由表2得VDR基因标准曲线方程为Y=-3.810X+33.618，曲线回归系数R2=0.999，说明VDR标准质粒在这几个稀释度范围内具有良好的线性关系。由表3得TRPV6基因标准曲线方程为Y=-3.212X+42.026，曲线回归系数R2=0.99，说明TRPV6标准质粒在这几个稀释度范围内具有良好的线性关系。

表2 VDR基因标准品标准曲线数据Table 2 Standard curve data of VDR gene standard

表3 TRPV6基因标准品标准曲线数据Table 3 Standard curve data of TRPV6 gene standard

2.2 小鼠感染H9N2病毒临床症状 小鼠通过滴鼻接种H9N2病毒后第3天出现明显的临床症状，包括精神沉郁、扎堆明显、被毛凌乱，体重从接种后第2天就已出现下降(图3A)，采食减少。接种后4～8 d，小鼠临床症状最为严重，基本不采食、消瘦、步态不稳，个别小鼠出现失明、弓背呼吸。感染后第8天，小鼠逐渐恢复采食，体重普遍开始增加，其他症状也逐渐减轻；到感染后第14天，小鼠症状基本恢复正常，但体重仍较对照组低(P<0.05)。与试验组相比，对照组的小鼠并未表现出异常症状。

肺系数是肺湿重与体重的百分比，是反应肺水肿程度最重要的指标之一。如图3B所示，与对照组相比，试验组小鼠的肺系数在感染后第3天较对照组显著升高(P<0.05)，第7天时最为严重，较对照组小鼠的肺系数高3倍左右(P<0.01)，到第14天 仍未恢复到正常水平，较对照组差异显著(P<0.05)，表明H9N2病毒感染会引起小鼠出现明显的肺水肿。

图3 H9N2病毒感染后小鼠体重(A)和肺系数(B)的变化Fig.3 Changes in body weight(A)and lung index(B)of mice infected with H9N2 virus*：P<0.05；**：P<0.01

2.3 小鼠十二指肠组织中VDR和TRPV6 mRNA表达变化VDR基因样本在实时荧光定量PCR后测得的Ct值代入标准曲线方程得到基因拷贝数，根据基因拷贝数作柱状图。从图4A可以发现：在H9N2亚型禽流感病毒感染后，小鼠十二指肠中的VDR基因表达量与对照组小鼠相比较总体是下调的。感染后的第3天VDR基因表达量已经出现显著下降(P<0.05)，仅有对照组表达量的1/5，并一直持续到感染后第21天。即在感染后21 d内，小鼠十二指肠内VDR基因表达被显著抑制。到感染后第28天 时，其基因表达量上升并显著高于对照组(P<0.05)。从图4B可以发现：H9N2病毒感染小鼠之后，小鼠十二指肠中TRPV6基因拷贝数的变化趋势与VDR基因类似，总体是下调的。在感染后第3天，TRPV6基因表达出现下调，但与对照组相比差异不显著(P>0.05)；到第7天表达量达到最低值，仅为对照组表达量的1/2(P<0.05)；在第14天和第21天，表达量仍显著低于对照组(P<0.05)；到感染后第28天时，TRPV6基因表达量基本恢复到正常水平(P>0.05)。

图4 小鼠十二指肠组织中VDR(A)和TPPV6(B)mRNA表达变化Fig.4 Changes of VDR(A)and TRPV6(B)mRNA expression in mouse duodenum tissue与对照组比较，*：P<0.05Compared to control group,*:P<0.05

3 讨论

有研究表明，H9N2禽流感病毒不经过适应就可以感染实验小鼠。本课题组用本实验所用的H9N2病毒毒株感染小鼠，小鼠出现了急性呼吸窘迫综合征[9]。本试验用该毒株滴鼻感染小鼠情况基本相似。感染剂量为1×106TCID50时，小鼠没有出现死亡情况，但症状非常明显。小鼠感染后精神沉郁，被毛杂乱，扎堆，体重下降，肺系数显著增加，说明肺组织出现明显水肿、出血。小鼠第3天开始出现明显症状，第7天最为严重，到第14天基本恢复，再现了从感染到发病再到痊愈的过程。

钙离子的总体摄入量主要依赖于肠道吸收。肠道中TRPV6是Ca2+选择性的离子通道，参与维持体内钙稳态。TRPV6属于维生素D依赖性蛋白。活化维生素D进入细胞后和胞浆内VDR结合，随后VDR和类维甲酸受体X(RXR)形成二聚体，进入细胞核，通过结合DNA上VDR反应原件(VDREs)调控基因的表达[10]。TRPV6基因的启动子上有多个VDREs，即TRPV6的表达受VDR的调节。有研究表明，VDR基因敲除小鼠肠道中TRPV6表达要比野生型小鼠下降90%左右[11]，肠道钙主动吸收的水平不足正常水平的30%[12]。本试验结果发现，H9N2病毒感染后，十二指肠中VDR和TRPV6基因表达均显著降低，并且影响时间较长，从第3天一直持续到了第21天。小鼠感染H9N2病毒后的感染高峰期在第3～5天，在第5～7天发病最为严重，从第7天或第8天开始恢复，到第14天基本恢复。说明小鼠在感染期、发病期、恢复期十二指肠中VDR和TRPV6 mRNA表达均受到显著抑制，有可能影响VDR和TRPV6蛋白的表达，进而可能影响到十二指肠对钙离子的吸收。

冬天光照时间短，皮肤合成的维生素D较少，因此机体内维生素D水平较低，进而影响钙离子的吸收和代谢[13]。而冬天正是流感暴发的高峰期。在维生素D水平较低的情况下感染流感病毒，就可能严重影响到肠道钙离子的吸收。特别是对于儿童和老年人来说，若他们不慎感染了流感病毒，从感染到痊愈甚至更长的一段时间钙吸收发生障碍，可能会导致严重的健康问题，如免疫力低下、心脏病发作等。目前，对钙代谢影响因素的研究主要集中在饮食、激素、年龄和一些疾病，如高血压、老年痴呆、糖尿病等，对于病毒感染影响肠道钙离子的吸收报道很少见[14]。本试验初步探索了H9N2流感病毒感染对十二指肠钙离子吸收的影响，希望对病毒感染和钙代谢的关系起到一定的启示作用。