盐度和钠离子/钾离子对凡纳滨对虾幼虾存活与组织结构的影响

苏家齐，祝华萍, 2，朱长波，张 博，李 婷，陈素文

（1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室/广东省渔业生态环境重点开放实验室，广东 广州 510300； 2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

中国内陆咸水资源丰富，以盐碱湖泊、地下咸水以及盐碱化沼泽的形式广泛分布在内陆的19个省级行政区，绝大多数处于闲置状态。盐碱水渔业以渔业开发为基础，对盐碱水资源进行有效利用，并在适宜盐碱水养殖的品种筛选及规模化养殖方面初具规模[1-2]。凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，可适应盐度范围为0.5～50，因抗逆性较强、盐度耐受性广等特点，在我国内陆地区有很大的养殖规模及产量，同时也是盐碱水养殖主要的驯养对象之一[3-5]。在凡纳滨对虾的内陆养殖过程中，人们往往采用地下咸水调节盐度或直接利用盐碱水资源开展养殖。盐碱水与海水在化学特性上存在明显差别，其中钾离子 (K+) 浓度较低、离子比例失衡等已被认为是其常见的特性之一，使得利用天然咸水进行对虾养殖的效果不理想[6-7]。即使在初始K+浓度正常的水体中，自然降水、池塘土壤对K+的吸附以及非交换性固定也易造成盐度和K+浓度降低[8-10]，因此，在对虾内陆养殖过程中，K+缺乏作为一个常见现象被广泛报道[11]。

因考虑到盐度的不同，学者们多用钠离子与钾离子的浓度比值 (Na+/K+) 作指标，针对凡纳滨对虾在盐碱水条件下的生理代谢、免疫酶活、生长存活等方面开展了一系列实验，以确定凡纳滨对虾生长的最适Na+/K+条件，而K+缺乏对凡纳滨对虾的毒性效应则鲜有报道[12-14]。此外，前期相关研究多在单一盐度环境下进行，多盐度条件下的报道仅见于Pathak等[15]与刘存歧等[16]利用天然盐碱水在盐度15、10、5条件下的凡纳滨对虾生长实验，以及Zhu等[17]利用人工盐碱水在盐度30和15条件下的生长代谢研究。本研究以内陆盐碱水养殖盐度较低、Na+/K+变化大、易波动的现象为背景，通过实验生态学方法，在温度为 (31±0.2) ℃、溶解氧质量浓度为 (5.8±0.1) mg·L−1条件下，对体质量为(1.35±0.37) g 的凡纳滨对虾在盐度 2、4、8、12、16梯度下开展了为期72 h的低钾胁迫实验，研究不同盐度下低钾胁迫凡纳滨对虾的半致死时间 (LT50)以及存活情况，同时结合肌肉和肝胰腺的组织结构变化，分析凡纳滨对虾低钾应激的生理响应过程，为其内陆盐碱水养殖以及环境调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 凡纳滨对虾 实验在中国水产科学研究院南海水产研究所珠海试验基地进行。所用凡纳滨对虾取自试验基地盐度为4的养殖池塘。选取凡纳滨对虾幼虾 1 600尾 (平均体质量 1.0 g、平均体长4.4 cm) 分别放置于 25只体积为 450 L 的玻璃钢圆桶中暂养，每5桶一组，共5组。暂养期间少量投饵并间利用曝气的自来水以及海水盐每天调节2的盐度，将各组盐度分别调整至2、4、8、12和16。在暂养第8天，即盐度为16组升到相应盐度48 h以上后作为实验用虾，此时幼虾平均体质量为(1.35±0.37) g、平均体长为 (4.95±0.49) cm。

1.1.2 主要试剂与设备 试剂：分析纯 KCl (生工生物)、无钾海水素 (江西海鼎科技有限公司)、海水晶 (广州海神水产科技有限公司)、波恩氏 (Bouin's)液。设备：ProPlus YSI水质分析仪 (美国维赛)、10 L透明带盖方形塑料桶、E6315-210 g-0.1 mg分析天平 (芯硅谷)、生物光学显微镜 (尼康) 等。

1.2 实验方法

1.2.1 低钾胁迫实验 实验设置 5个盐度水平：2、4、8、12、16，设置 6个 Na+/K+水平：27、50、75、100、125、150，盐度和 Na+/K+共 30个组合，每个组合分别设置3个重复。实验在充气的10 L透明塑料桶中进行，每桶盛放8 L水，放置10尾对虾。利用人工无钾海水素、充分曝气的自来水 (Na+: 10.9 mg·L−1, K+: 2.49 mg·L−1) 和分析纯KCl配置实验用水，其中Na+/K+27为对照组，K+浓度正常，其余为低钾实验组 (表1)。实验期间各组溶解氧控制在 (5.8±0.1) mg·L−1，每 3 h 观察并记录实验虾的死亡情况，并及时将死亡对虾捞出。为减少因饥饿造成的对虾互相残食，每24 h少量投饵1次并及时清理粪便，实验进行到第36小时半量换水1次。

表1 实验用人工海水的盐度、钠离子与钾离子质量浓度和钠离子/钾离子Table 1 Salinity, concentration of Na+, K+ and Na+/K+ ratio of experimental artificial seawatermg·L−1

1.2.2 组织样品的采集与处理 根据低钾胁迫实验结果，取盐度为4、8、12、16，Na+/K+为27、100、125、150共16个组合，在相同条件下对凡纳滨对虾幼虾进行胁迫实验。在实验进行到第48小时取各组还存活的对虾2尾，取背部肌肉以及完整的肝胰腺组织放入波恩氏液中固定，24 h后用70%乙醇清洗多余的波恩氏液，之后保存于70%乙醇中用于石蜡切片的制作和观察。参照魏杰等[18]的方法，组织经乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包片、切片、HE染色、树胶封片、干燥等步骤后，用生物光学显微镜观察并拍照。

1.3 数据计算与分析

实验数据使用 SPSS 19.0和 Excel 2016软件进行分析，参照Ramirez等[19]与Honkanen等[20]的方法，使用SPSS 19.0软件中的probit回归模型计算低钾胁迫下凡纳滨对虾的LT50，通过Kaplan-Meier生存分析模块绘制生存函数。对成活率作双因素方差分析，如果差异显著 (P<0.05)，则进一步对同一盐度或Na+/K+下的各处理组进行Duncan's多重范围检验。不满足方差齐性时，对数据进行自然对数或平方根转换。通过Excel 2016软件进行盐度与对虾第72小时成活率回归分析。

2 结果

2.1 不同盐度和Na+/K+下凡纳滨对虾的累计生存情况及LT50

Na+/K+为27的对照组以及Na+/K+为50的实验组个体表现正常，截止到第72小时实验结束，各组成活率均高于75%。Na+/K+为75以上各实验组凡纳滨对虾的死亡情况总体表现为随水体盐度的上升而增加。Na+/K+越高，不同盐度下对虾的死亡率差异随胁迫时间延长越明显。其中Na+/K+为150时，盐度16组的受试对虾在60 h内全部死亡，而盐度2、4、8、12组在第60小时的成活率则分别为90%、73.33%、63.33%、46.66%。Na+/K+为75的条件下，盐度2、4、8、12、16组在第60小时的成活率分别为86.66%、80%、83.33%、86.66%、80%；第72小时的成活率分别为83.33%、76.66%、80%、73.33%、66.66% (图1)。

图1 不同盐度和钠离子/钾离子下凡纳滨对虾幼虾的成活率Figure 1 Survival rate of L. vannamei in artificial seawater at different Na+/K+ ratios and salinities

Probit回归模型预测结果显示，凡纳滨对虾的LT50随着Na+/K+和盐度的升高而降低 (表2)。实验观察结果显示，在Na+/K+为100时，盐度12和16条件下凡纳滨对虾的LT50均为63 h；Na+/K+为125时，盐度12和16条件下凡纳滨对虾的LT50分别为60和45 h；Na+/K+为150时，盐度12和16条件下凡纳滨对虾的LT50分别为60和39 h。在Na+/K+为100、125、150条件下凡纳滨对虾第72小时的成活率与盐度的回归方程分别为lny=0.120 8x+10.099 (R2=0.877 5)、lny=0.127x+11.705(R2=0.982 2)、lny=0.119 5x+16.235 (R2=0.979 7)。

表2 不同钠离子/钾离子下凡纳滨对虾幼虾半致死时间Table 2 Regression equation between half lethal time and salinity of juvenile L. vannamei

2.2 不同盐度和Na+/K+对凡纳滨对虾幼虾72 h成活率的影响

不同盐度与Na+/K+下凡纳滨对虾的成活率见表3。在盐度2条件下，不同Na+/K+组成活率均高于80%且彼此差异不显著 (P>0.05)。在盐度4条件下，Na+/K+为27的正常对照组成活率最高(93.33%)，与Na+/K+为150成活率最低组差异显著(P<0.05)，与其他组差异不显著 (P>0.05)。在盐度8条件下，Na+/K+为150实验组成活率最低并显著低于除Na+/K+为125外的其他各组 (P<0.05)，正常组的成活率最高且显著高于Na+/K+为125的实验组 (P<0.05)。在盐度12和16条件下，凡纳滨对虾幼虾成活率随着Na+/K+升高出现明显降低的趋势，Na+/K+为27、50和75组的成活率显著高于其他各组。双因子方差分析结果显示，盐度、Na+/K+及交互对凡纳滨对虾的成活率影响极显著 (P<0.001)。在Na+/K+为27、50、75条件下，盐度2～16各组之间成活率无显著差异 (P>0.05)。当Na+/K+大于100时，整体上凡纳滨对虾的成活率呈现随盐度升高而下降的趋势，Na+/K+为100时，盐度2～8组的成活率高于盐度12和16组且差异显著 (P<0.05)；Na+/K+为125时，盐度2和4组的成活率最高且差异不显著 (P>0.05)，其他各组之间差异显著 (P<0.05)；Na+/K+为150时，盐度4组与盐度2、8组成活率差异不显著 (P>0.05)，其他各组之间差异显著 (P<0.05，表3)。

表3 不同盐度、钠离子/钾离子下凡纳滨对虾成活率Table 3 Survival rate of L. vannamei at different salinities and Na+/K+ %

2.3 盐度和Na+/K+对凡纳滨对虾肝胰腺及肌肉组织结构的影响

对虾的肝胰腺由发达的多级分支的小管组成，肝胰腺小管间具有脂肪组织与结缔组织，并伴有血管分布。肝胰腺小管外壁由单层柱状上皮细胞构成，管腔的横切面多呈多角星或卵圆形 (图2-a)。盐度4、Na+/K+为150的实验组对虾肝胰腺小管壁组织完整，小管排列比较整齐且边界清晰，与对照组无明显差异 (图2-b)。盐度8、Na+/K+为150的实验组对虾肝胰腺小管排列比较整齐，但可见部分肝胰腺的小管壁出现破损 (图2-c)。盐度12、Na+/K+为125的条件下，对虾肝胰腺小管管腔缩小，同时小管形状与排列不规则 (图2-e)。盐度12、Na+/K+为150，盐度16、Na+/K+为125的实验组对虾肝胰腺小管排列混乱，部分肝胰腺小管间的边界模糊，管腔几乎不可见，可见细胞核和组织残片散落在肝小管间隙 (图2-d、2-f)。

图2 不同盐度和钠离子/钾离子对凡纳滨对虾肝胰腺显微结构的影响 (HE 染色，200×)a. 盐度 4，钠离子/钾离子 27，示基膜 (BM) 和管腔 (L)；b. 盐度 4，钠离子/钾离子 150；c. 盐度 8，钠离子/钾离子 150，示肝胰腺小管基膜破损；d. 盐度12，钠离子/钾离子 150，示肝胰腺小管管腔变形；e. 盐度12，钠离子/钾离子 125；f. 盐度16，钠离子/钾离子 125，示肝胰腺小管界限模糊。Figure 2 Effects of salinity and Na+/K+ on hepatopancreas microstructure of L. vannamei (HE staining, 200×)a. Salinity 4, Na+/K+ 27, showing basement membranes (BM) and lumen (L); b. Salinity 4, Na+/K+ 150; c. Salinity 8, Na+/K+ 150, showing basement membranes of hepatopancreas tubule were ruptured; d. Salinity 12, Na+/K+ 150, showing lumen variant; e. Salinity 12, Na+/K+ 125;f. Salinity 16, Na+/K+ 125, showing the demarcation line of hepatopancreas tubule was blurred.

实验开始12 h后，盐度12与16，Na+/K+为100～150的各组对虾活动迟缓，停止摄食。死亡率随着胁迫时间的延长而上升，同时肉眼可见对虾背部肌肉发白。不同盐度和Na+/K+下凡纳滨对虾幼虾肌肉组织显微结构见图3。盐度4各实验组对虾肌肉纤维排列整齐、紧密，肌肉束间隙较小 (图3-a、3-b)；盐度8、Na+/K+为150的实验组对虾肌纤维排列整齐，但肌纤维间隙较对照组有所增大 (图3-c)；盐度12、Na+/K+为125的实验组对虾肌纤维间隙宽度增加，可见肌细胞细胞核散落在组织间隙中。随着盐度或Na+/K+的进一步升高，对虾肌纤维发生自溶或者断裂，肌肉组织结构模糊不清，其中盐度16、Na+/K+为125的实验组对虾肌肉组织病变的情况较盐度12、Na+/K+为150的实验组更为严重 (图 3-d、3-f)。

图3 不同盐度和钠离子/钾离子对凡纳滨对虾肌肉显微结构的影响 (HE 染色，200×)a. 盐度 4，钠离子/钾离子 27；b. 盐度 4，钠离子/钾离子 150；c. 盐度 8，钠离子/钾离子 150；d. 盐度 12，钠离子/钾离子 150；e. 盐度 12，钠离子/钾离子 125；f. 盐度 16，钠离子/钾离子 125。Figure 3 Effects of salinity and Na+/K+ on muscle microstructure of L. vannamei (HE staining, 200×)a. Salinity 4, Na+/K+ 27; b. Salinity 4, Na+/K+ 150; c. Salinity 8, Na+/K+ 150; d. Salinity 12, Na+/K+ 150;e. Salinity 12, Na+/K+ 125; f. Salinity 16, Na+/K+ 125.

3 讨论

3.1 低钾胁迫对凡纳滨对虾的毒理效应

作为水生动物必需矿物元素之一，钾对于保持体液的渗透压和酸碱平衡、维持动物肌肉和神经的正常效能起着非常重要的作用[21]。Pillard等[22]利用人工配置海水，在盐度31的环境下测试K+浓度对糠虾 (Mysidopsis bahia) 48 h 内存活的影响，结果显示不仅高钾，低钾也会引起糠虾死亡。研究表明，在低钾情况下，眼斑拟石首鱼 (Sciaenops ocellatus)、日本鳗鲡 (Anguilla japonica) 的成活率均随Na+/K+增加和胁迫时间的延长而降低[21,23]。本研究中凡纳滨对虾在相同盐度下的死亡率随Na+/K+的增加呈上升趋势，与上述实验结果相似。Prang-nell和Fotedar[24]研究了不同K+浓度盐碱水和添加淡水对宽沟对虾 (Penaeus latisulcatus) 生理指标的影响，结果显示Na+/K+为107.9的高Na+/K+组宽沟对虾在第24小时的渗透压调节能力、血钾、血镁显著低于Na+/K+为31.9和25.3的低Na+/K+组，肌肉含水量则显著高于后两组。低Na+/K+组宽沟

对虾的血清渗透压、钠浓度和渗透压调节能力在盐度胁迫24 h后停止下降并保持稳定，而高Na+/K+组则在实验期间持续下降，表明严重缺钾不仅会增加对虾的能量消耗，降低血钾，还对宽沟对虾的渗透调节功能造成破坏。Zhu等[12]在盐度30的环境下开展了7个Na+/K+梯度的凡纳滨对虾养殖实验，结果显示高Na+/K+降低了对虾的湿质量、增重率、特定生长率和食物转化率，Na+/K+为110.5组的对虾在2周内全部死亡。本研究中，在盐度为12和16、Na+/K+为125和150的环境下，凡纳滨对虾行动迟缓并停止摄食、LT50明显降低，表现出高Na+/K+对凡纳滨对虾的急性毒性效应，可能是由于高Na+/K+对凡纳滨对虾的渗透压稳态造成严重破坏，引发虾血钾浓度快速降低等急性刺激所造成的，具体原因有待于进一步研究证实。

3.2 盐度对凡纳滨对虾低钾耐受性影响

本实验结果显示，盐度能够对Na+/K+胁迫下的凡纳滨对虾的存活情况产生明显影响，即低盐度下虾对异常Na+/K+的适应能力高于高盐度下，对高Na+/K+的耐受范围更广。中长期对虾养殖实验结果也表明，高Na+/K+条件下，低盐度环境往往会取得更好的养殖效果。Valenzuela-Madrigal等[14]在盐度1.2±0.5的条件下开展了4周的凡纳滨对虾养殖实验，结果显示Na+/K+为162.5的实验塘中对虾成活率达到76.4%，而在盐度4、Na+/K+为120的条件下，4～6周的成活率仅为10%～21.25%[25-26]。Zhu等[15]在盐度30和15的条件下，分析了不同Na+/K+对凡纳滨对虾幼虾生长、物质和能量吸收及食物转化率的影响，结果表明盐度30下，对虾在Na+/K+(mg/mg) 为 20.1～27.9范围内能获得良好生长，在盐度约15的环境下将水体Na+/K+降低到44.8，即可达到较好的养殖效果。

在氨氮 (NH4-N)、亚硝酸盐对凡纳滨对虾和墨吉对虾 (Fenneropenaeus merguiensis) 的毒性试验中，氨氮、亚硝酸盐的毒性随盐度的降低而升高，即低渗环境可以降低对虾对氨氮、亚硝酸盐的耐受性[27-29]。而在低K+环境下，低渗环境提高了凡纳滨对虾对低K+条件的耐受。Partridge和Lymbery[30]研究显示，高渗条件下尖吻鲈 (Lates calcarifer) 对K+的需求更高，在盐度为45的高渗条件下，尖吻鲈在Na+/K+为108的环境下无法存活，在Na+/K+为54的环境下表现为负生长，而在盐度为15和5的低渗环境下的生长与正常环境组无明显差异。Tantylo和Fotedar[31]在盐度分别为5、15、25、35的环境下，对斑节对虾 (P. monodon) 开展Na+/K+为120的胁迫实验，结果显示盐度15、25、35下斑节对虾在第6、第7、第10天全部死亡，仅盐度5下的斑节对虾有较强的血淋巴渗透压和Na+、K+、Ca2+、Mg2+调节能力，实验结束后获得88.9%以上的成活率。在一定的盐度范围内，盐度降低，高Na+/K+的毒性随之降低，这可能与盐度影响对虾的渗透压和钾代谢有关。因此，养殖生产者在考虑水体中K+浓度时，还须将盐度作为一个重要考虑因素。

3.3 低钾胁迫对凡纳滨对虾肌肉和肝胰腺组织结构的影响

人体中细胞内和胞外钾离子浓度梯度对维持细胞静息电位、神经肌肉兴奋性和心肌自律性十分重要，低血钾可导致心律失常、肌无力、骨骼肌痉挛、横纹肌溶解等症状[32]。Knochel等[33]认为，骨骼肌在运动过程中需要释放K+来维持小动脉的扩张，进而保证肌肉的正常供血，缺钾会导致肌肉因供血不足而发生自溶。低血钾兔心肌切片显示心肌细胞肿胀、排列紊乱，胞质内可见大小不等的空泡。陆敏等[34]认为低血钾降低了Na+-K+-ATP酶活性，影响了心肌细胞的代谢并导致其坏死。Tantylo和Fotedar[31]研究指出高Na+/K+会引起斑节对虾血清钾浓度降低，盐度越高，斑节对虾对血钾的维持能力越弱。在缺钾条件下，高渗和等渗环境下尖吻鲈通过骨骼肌中的K+来维持血钾的稳定[30]。对虾的肌肉属于横纹肌，本研究中对虾在高Na+/K+条件下肌肉自溶或断裂的现象与缺钾的症状相似，且随着盐度的升高该现象更加明显，表明高盐度会加剧因高Na+/K+引起的对虾肌肉钾缺乏症状。

本研究发现，高Na+/K+及盐度会造成凡纳滨对虾肝胰腺组织的损伤，在高Na+/K+下，随着盐度升高，对虾首先出现肝胰腺小管壁破损现象，继而出现比较明显的形态结构变化。肝胰腺是对虾能量物质代谢的主要场所，在日本沼虾 (Macrobrachium nipponense) 的低氧胁迫和克氏原螯虾 (Procambarus clarkii) 的低pH胁迫试验中，虾的肝胰腺小管中B细胞转运泡体积首先出现变化，后随着时间延长小管形态出现挤压变形等变化，未见细胞坏死等描述[35-36]。而在塔玛亚历山大藻毒素对中国明对虾 (F. chinensis) 急性毒性实验中，虾肝小管排列较整齐，边界较清晰，但肝小管出现变形，可见坏死的细胞核以及残余组织散落在小管间隙[37]。Pathak等[15]研究显示缺钾型内陆盐碱水养殖的凡纳滨对虾肝胰腺组织出现了管腔变形、血细胞浸润、小管基膜坏死、组织残片和细胞崩解等现象。与pH、溶解氧等环境因子胁迫相比，高Na+/K+主要引起了肝胰腺小管细胞坏死，对小管细胞的分泌功能和分泌活动的影响不明显，组织观察效果与外源毒素对虾类肝胰腺破坏效果更类似。

综上所述，本研究表明Na+/K+和盐度对凡纳滨对虾幼虾存活存在交互作用。盐度能够对Na+/K+胁迫下的凡纳滨对虾存活产生明显影响。在较低盐度下，凡纳滨对虾对高Na+/K+耐受性更强，耐受范围更广。在Na+/K+大于75、盐度大于8的条件下，随着盐度或Na+/K+升高，凡纳滨对虾LT50和72 h成活率明显降低。水中的K+缺乏会对凡纳滨对虾肌肉和肝胰腺组织结构造成损伤，盐度越高毒性效果越明显。因此，在开发利用缺钾型盐碱水进行凡纳滨对虾养殖时，应综合盐度因素考虑Na+/K+对凡纳滨对虾的影响。在低盐条件下，缺钾对凡纳滨对虾短期存活的影响往往并不显著，但在长期养殖过程中，仍需关注钾缺乏对其生长的影响。